腺病毒载体COVID-19疫苗：工艺和成本分析
来自美国Intelligen, Inc.,等的研究人员在2021年第9期的《Processes》杂志上发表了题为“Adenoviral Vector COVID-19 Vaccines: Process and Cost Analysis”的文章。文中，研究人员指出，COVID-19大流行推动了许多疫苗的快速开发，这些疫苗已被证明对SARS-CoV-2有效，其中一些成功的疫苗是基于腺病毒载体平台的。大规模生产这些疫苗带来了巨大的挑战，特别是在大流行的背景下，必须以负担得起的成本迅速生产大量的疫苗。为此，研究人员利用SuperPro Designer软件设计、模拟和经济性评估了生产COVID-19腺病毒载体疫苗的两种基线工艺B1和P1。B1采用批次细胞培养病毒生产步骤，病毒滴度为5 x1010病毒颗粒(VP)/mL。P1采用灌流细胞培养病毒生产步骤，病毒滴度为1 x1012 VP/mL。将两种工艺的规模定为每年4亿剂疫苗。与B1相比，P1的每剂成本更低 ($0.15 vs. $0.23)，所需的资本投入也更少(1.26亿美元 vs. 2.99亿美元)。培养基和工厂相关费用是运营成本的主要来源。结果表明，腺病毒载体疫苗可以大规模、低成本地生产。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
“需求是发明之母”这句名言，恰如其分地描述了近期COVID-19疫苗以前所未有的速度研发的经验。截至2021年5月底，研究人员正在进行92种疫苗的人体临床试验，其中28种已进入III期，至少还有77种疫苗正在动物中进行临床前测试，可能会有更多的候选疫苗进入人体临床研究。这些疫苗主要基于四种不同的疫苗平台：灭活病毒、蛋白质亚单位、腺病毒载体和mRNA。
疫苗旨在“武装”个人的免疫系统，以在未来接触有害的病毒或细菌病原体时，提供保护。为了实现这种保护，疫苗必须在某种程度上类似于它们所针对的病原体，同时不引起感染。传统疫苗使用的是高度衰减的病原体，其不会引起严重的感染，但可提供足够的“暴露”，以形成免疫记忆，并在未来暴露于病原体时，提供保护。这一策略今天仍在使用，并被用于几种COVID-19疫苗的开发。用灭活病毒接种不需要预先知道哪些病毒成分(抗原表位)引起保护性抗体反应，而是允许免疫系统识别整个病毒，形成针对病毒多个部分的免疫反应。
虽然早期疫苗开发是一种“碰运气”的策略，但随着今天很多工具可在分子水平上探索生物学特性并进行干预，出现了许多新的疫苗策略。这些新兴的疫苗平台不需要灭活病毒，而是针对病毒的目标部分，从而加快开发时间，生产出安全的产品。例如，研究已经确定刺突(S)蛋白是SARS-CoV-2的一个重要的抗原靶点。因此，除灭活病毒外，很多COVID-19候选疫苗都将刺突蛋白与用于主要候选疫苗的三种不同策略相结合：蛋白质亚单位、腺病毒载体和mRNA。本研究将以腺病毒载体疫苗为主。
腺病毒载体疫苗平台
病毒已经进化到能够非常有效地感染宿主细胞，然后“劫持”宿主的细胞机制进行自我复制。病毒被免疫系统检测到，并刺激先天和获得性免疫反应，形成有效的免疫记忆，保护宿主免受再次感染，因此，病毒被用作疫苗抗原信息(基因)的载体。在作为病毒载体的使用中，天然病毒经过了基因修饰，从而可以递送抗原蛋白的DNA模板，为疫苗抗原的生产提供了一个“原位工厂”。
虽然有多种病毒被用作病毒载体(如腺相关病毒、痘病毒、慢病毒等)，但腺病毒有以下几个优点：
它们能够感染广泛的细胞类型以及分裂和非分裂细胞；
它们相对安全，因为大多数野生型腺病毒引起轻微或无症状感染；
它们的分子生物学已被良好了解，它们的DNA也很容易操纵；
它们可以封装相对较大的片段插入(第一代载体~5 kb)；
插入突变的风险较低；
可以达到高滴度(在合适的细胞系和细胞培养条件下)；
相对较好的热稳定性
然而，腺病毒在用作病毒载体方面也面临着一个重大障碍：人类群体对某些血清型具有一定的预先免疫性，这可能会降低它们的实际效力。通常采用两种策略来规避这一问题：使用人群中流行率较低的血清型(如Ad35或Ad26)；或使用非人腺病毒(如猿、犬、牛、羊、猪或禽腺病毒)。大多数COVID-19腺病毒载体疫苗采用了这两种方法中的一种：牛津-阿斯利康疫苗基于黑猩猩腺病毒；强生疫苗使用Ad26血清型。
此外，在所有疫苗中，都对腺病毒载体进行了修饰，以防止腺病毒的复制，即腺病毒为复制缺陷型。这是一种安全特性，可保护接种者免受潜在的严重不良反应，特别是免疫功能低下的患者、儿童和老年人。复制缺陷型腺病毒通常通过部分或全部敲除E1基因获得。E3基因一般也会被敲除；E3对病毒复制不是必需的，但可帮助病毒逃避免疫监视。这些基因的敲除也为更大的插入创造了空间。复制缺陷型腺病毒的大规模生产需要宿主细胞系提供敲除的复制基因(E1)，最常见的是HEK 293和PER.C6。这些细胞系可以驯化适应无血清培养基悬浮培养，在补料分批或灌流培养中达到高细胞密度和高病毒产量。值得注意的是，在COVID-19腺病毒载体疫苗之前，只有两种病毒载体疫苗被批准用于人类使用，且都是针对埃博拉的：2019年的rVSV-ZEBOV和2020年的Zabdeno/Mvabea。
COVID-19大流行突出了应对此次和未来大流行的一些重要疫苗特性，即开发速度、迅速扩大产能的能力，以便在全球范围内供应疫苗，且需基于所有人都能获得疫苗的成本。
最近有研究对COVID-19 mRNA疫苗的生产进行了详细的技术 - 经济分析，揭示了与该技术相关的挑战，特别是在大流行的背景下。在本研究中，将对基于腺病毒载体的COVID-19疫苗进行了技术 - 经济分析，腺病毒载体是一项成功抗击该疾病的主要技术。目前的工作突显了腺病毒平台有利的经济性和放大潜力。
工艺描述
研究对腺病毒疫苗生产的4种工艺进行了建模和评估：2种基于批次细胞培养(B1和B2)，两种基于灌流细胞培养(P1和P2)。在所有方案下，假设携带SARS-CoV-2刺突(S)蛋白基因的复制缺陷型腺病毒由悬浮培养的互补哺乳动物细胞生产 (如PER.C6或HEK-293)。
批次方案 (B1和B2)：在批次工艺中，病毒生产阶段包括在不锈钢搅拌罐生物反应器中的宿主细胞生长阶段以及之后在相同反应器内的感染。B1和B2的根本区别是在病毒生产步骤中达到的病毒滴度，B1和B2的水平分别为5 x 1010 VP/mL和1 x 1011 VP/mL。
灌流方案 (P1和P2)：在灌流工艺中，每次运行使用两个配备外置交替式切向流 (ATF) 过滤系统的一次性使用生物反应器(SUB)。宿主细胞先在第一个生物反应器中扩增，然后转移到第二个生物反应器进行病毒生产。两个阶段均以灌流模式进行。P1和P2的根本区别是在病毒生产步骤中达到的病毒滴度，P1和P2的水平分别为1 x 1012 VP/mL和2 x 1012 VP/mL。
灌流和批次方案的另一个差异在于分别使用一次性使用和不锈钢设备。在批次工艺中，所有体积大于1,000 L的混合和存储步骤都在传统的不锈钢设备中进行，而灌流工艺中的混合和存储步骤只在一次性使用袋中进行。
所有工艺使用类似的下游工艺步骤，其能适应不同VP产量范围：
步骤1和3 - 7是腺病毒回收和纯化的典型工艺步骤。然而，细胞裂解后DNA的选择性沉淀(步骤2)是最近提出用于提高残留DNA清除的方法。下图所示为在SuperPro Designer中针对批次方案 (B1和B2)创建的简化工艺流程图。
COVID-19腺病毒载体疫苗生产的简化工艺流程图。
所有方案均考虑为每年48周的运营时间。此外，在所有方案中都假定循环时间为3.5天。考虑到某些细胞培养步骤需要超过3.5天，在这些步骤中增加了额外的设备单元，以交错模式(批次间更换交替)操作，因此这些步骤的有效循环时间为3.5天。为确定设备大小和生产批量，假设每年的疫苗产量足以为2亿人接种两剂5 x 1010 VP疫苗。这个总剂量(1 x 1011 VP)代表年度生产目标2.2 x 1019 VP/年(包括10%的溢出)。
接种液制备
批次工艺操作，请参考原文。
灌流工艺（P1 和P2）：灌流工艺开始时采用与批次工艺相同的细胞扩增方法，但在每个阶段的细胞接种和最终细胞密度更高；开始时细胞密度为0.5 x 106 cells/mL，培养87 h后细胞密度为3.5 x 106 cells/mL。病毒产生阶段之前的最后细胞扩增步骤以灌流模式进行。在这一步中，细胞培养使用配备ATF灌流系统的一次性使用生物反应器，它包括两个阶段:：
批次阶段需要4天，获得细胞密度为5 x 106 cells/mL。批次阶段遵循此前提到的指数增长模型，使用同样的倍增时间31 h。
灌流阶段需要6天，获得细胞密度约为50 x 106 cells/mL。灌流速率设置为每天2个工作体积。假设微滤膜对细胞的截留系数(RC)为1.00，回收率(滤液/进样)为99.5%。灌流阶段遵循化学计量模型，转化率为90%。
病毒生产
病毒复制只发生在每个工艺上游部分的最后阶段。在批次工艺中以批次方式执行，在灌流工艺中以灌流方式执行。在这两种方案中，病毒培养温度为36 ℃，通气率与细胞生长时相同(0.05 VVM)。
批次工艺病毒生产操作，请参考原文。
灌流工艺（P1和P2）：在灌流工艺中，病毒复制在配备外置ATF过滤系统的一次性使用生物反应器中进行。在这种情况下，病毒生产不包括细胞生长阶段，而是两个病毒复制阶段：批次阶段和灌流阶段。
批次病毒复制阶段：灌流获得的高密度细胞培养用新鲜培养基稀释，使初始细胞密度等于15 x 106 cells/mL。经过短暂的混合(10 min)，培养液被浓缩的腺病毒种子感染，从而开始批量复制阶段。病毒种子浓度和MOI分别为1 x 1012 VP/mL和70。病毒复制以批次模式进行5 h；这个阶段用与批次工艺中病毒复制相同的化学计量法表示，系数νVP等于灌流阶段的系数。这一阶段的转化率假定为10%。在批次阶段结束时，打开ATF灌流系统，开始灌流阶段。
灌流病毒复制阶段：这个阶段需要4天，用与批次阶段相同的化学计量模型表示。灌流速率为每天2个工作体积，此阶段的转化率为80%。指定系数νVP，使VP的最终浓度在方案P1中等于1.0 x 1012 VP/mL，在方案P2中等于2.0 x 1012 VP/mL。这些值涵盖了文献中报道的一系列结果。ATF滤膜对细胞的截留系数为1.00，对VP的截留系数为0.98。
下游步骤操作以及详细的实验结果，请参考原文。
分析总结。B1和B2为基于批次细胞培养的方案，P1和P2为基于灌流细胞培养的方案。
每种工艺方案的总运营成本（以每剂成本计算）和细分。每剂疫苗含有5 x1010VP。
总运营成本（以每剂成本计算）按工艺部分进行细分。每剂疫苗含有5 x1010 VP。
生产规模对资本投入的影响。批次工艺的病毒产率为1 x1011 VP/mL，管路工艺的病毒产率为2 x 1012 VP/mL。
生产规模对总体运营成本的影响（以每剂成本计算）。批次工艺的病毒产率为1 x 1011 VP/mL，管路工艺的病毒产率为2 x 1012 VP/mL。随着生产规模从每年4亿剂增加至8亿剂，2种工艺的每剂成本均可显著下降（批次下降28%，灌流下降25%），进一步增加到每年16亿剂，两种工艺的每剂成本可分别进一步下降18%和14%。
总结
本研究设计了4种生产COVID-19腺病毒载体疫苗的工艺：2种基于批次细胞培养，2种基于灌流细胞培养。在过程模拟软件工具的帮助下进行了全面的技术 - 经济分析。除了用于生产病毒的细胞培养的类型，这些工艺在一次性使用设备的使用以及工艺上游部分获得的病毒滴度方面也有所不同。因此，可以估计并比较每种方案的总资本投入和运营成本。细胞培养基和工厂相关的费用是疫苗生产成本的主要成本驱动因素。上游部分对疫苗资本投入和运营成本的贡献最大。结果还表明，与批次方案相比，灌流方案可以降低运营成本，并大幅降低资本投入，批次方案需要更大的工厂占地面积。研究还对这2种工艺的生产规模的影响进行了评估，结果表明，产量从每年4亿剂增加到每年8亿剂或16亿剂，将显著降低每剂的资本和运营成本。
尽管在COVID-19大流行之前，病毒载体疫苗尚未被普遍使用，但今天，已有一些成功用于抗击SARS-CoV-2的疫苗是基于腺病毒载体平台的。而且，很有可能，未来的许多疫苗都将基于这种技术。在大流行的背景之下，病毒载体疫苗是一种特别方便生产的疫苗类型。将不同的抗原引入病毒载体相对直接，因此新型疫苗可以相当迅速地开发出来。我们认为，当前研究的结果可以帮助学术界和产业界的科学家优化疫苗生产并降低生产成本，无论是COVID-19疫苗，还是更普遍的的其它候选疫苗。目前的分析还有助于提高疫苗定价的透明度。最后，考虑到基因治疗领域的病毒载体生产工艺与病毒载体疫苗生产工艺本质上有很大的相似性(尽管疫苗的生产规模可能要高得多)，这项研究可能对那些利用腺病毒载体进行基因治疗的人有所帮助。
原文：R.G.Ferreira, N.F.Gordon, R.Stock, et al., Adenoviral Vector COVID-19 Vaccines: Process and Cost Analysis. Processes, 2021, 9, 1430.
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