BMS：在高浓度制剂应用中，一次性膜包是重复使用膜包经济高效的替代方案
来自美国Bristol Myers Squibb的研究人员在2021年2月的《Biotechnology and Bioengineering》杂志上发表了题为“Process analytical technolgy for on-line monitoring of quality attributes during single use ultrafiltration/diafiltration”（用于一次性使用超滤/洗滤过程中在线监测质量属性的过程分析技术）的研究文章。研究开发了一种用于在达到100-200g/L 极高浓度mAb药物底物制剂的超滤/洗滤应用中进行在线质量属性监测的工艺分析技术（PAT），同时比较了在此应用中重复使用和一次性使用平板膜包的性能。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
摘要：过程分析技术(PAT)是生物工艺中一个快速发展的领域，它使生物药生产的创新成为可能。本研究展示了一种新的PAT方法，可用于在超滤/洗滤(UF/DF)过程中同时监测多个质量属性，UF/DF是单克隆抗体(mAb)纯化的最后一步。体积排除色谱(SEC)方法被开发用于检测赋形剂精氨酸、组氨酸和高分子量(HMW)物质，其针对在线和近线模式使用液相色谱(LC)系统以及自动采样器。将该方法应用于UF/DF研究，以比较一次性使用切向流过滤(TFF)膜包与标准可重复使用膜包在达到100-200 g/L量级的极高浓度单抗（mAb）药物物质(DS)时的性能。这些案例研究表明，一次性使用TFF膜包是标准可重复使用膜包功能等效而成本更低的替代品，在线PAT检测纯度和赋形剂浓度的方法与离线正交方法相当。这些PAT应用使用了配备板载样品稀释的在线LC系统，可以成为一个平台系统，在广泛的动态范围内监测多种属性，是生物药开发和生产的潜在高价值工具。
2004年，美国食品和药物管理局提出了一个过程分析技术(PAT)框架，作为一种策略，旨在解决制药行业在这方面的差距并促进创新。从公共卫生的角度来看，需要创新来提高药品的产量、优化质量并降低成本。特别是生物药(生物制品)的销售在过去十年中显著增长，增加了将PAT纳入生物药生产过程的潜在投资回报。PAT将质量源于设计 (QbD)、分析仪器以及自动取样和分析等要素整合到生物药生产过程当中。这与传统的过程中取样检测不同。目前，大多数样品都是在不同的时间点手动从过程中采集，然后转移到独立的质量控制(QC)实验室进行离线分析。PAT可以利用实时数据来执行反馈和前馈过程控制，并为实时的过程中放行策略铺平道路。在过程中，实时放行可以显著提高过程的节奏，从需要多个小时的离线分析切换到在线自动分析，几分钟就可产生结果。
本研究开发的PAT方法的重点是加速开发高浓度单克隆抗体(mAb)和生物药的超滤/洗滤(UF/DF)工艺操作。生物药之所以被制剂为高浓度是因为蛋白质药物皮下注射(SubQ)技术的出现。SubQ注射给药是一项重大进步，因为它可以方便地在家自行给药，而不是需要前往诊所在医疗监测下进行长时间的静脉输注给药。实现这种方式的一个关键成分是重组酶人透明质酸酶被批准用于人体。透明质酸酶水解皮下透明质酸，使药物物质有效地吸收并分散到皮下空间，且给药导致的疼痛和组织肿胀最小化。然而，皮下注射需要小于1.5 ml的注射量。因此，必须使用明显更高浓度的药品(DP)来提供有效治疗所需的剂量。为了实现这一目标，需要优化目前的UF/DF操作，使DS浓度达到200g/L或更高。这里具体的UF/DF操作是指最后的工艺操作步骤，纯化的mAb被洗滤至制剂缓冲液、浓缩、然后制剂成DS，再将DS制成小瓶包装的DP。在高蛋白质浓度条件下，基于UF/DF的DS生产方法从制剂和操作角度提出了特定的挑战。DS浓度越高，相对于洗滤缓冲液的目标pH值和赋形剂浓度漂移越大；观测到的漂移是Donnan排除和体积排除效应的产物。更高的浓度会导致粘度显著增加，从而大大增加通过切向流过滤(TFF)设备的压降，提高泵送物料所需的动力。更高的粘度也需要添加降低粘度的赋形剂，以方便SubQ注射。UF/DF后的回收工艺也具有挑战性，因为只使用最少的缓冲液来冲洗系统，以避免稀释超过最终目标浓度。最后，高浓度也会促进聚体的形成，这可能是由于更高的分子聚拢/自交联所致。
在本研究中，使用在线和近线PAT分析以及离线分析测试，在多个案例中评估了一次性使用UF/DF技术。随着工艺强化和生物药连续生产的发展，为了提高生产率并降低资本投入和劳动力成本，行业已在不同的单元操作中使用了一次性使用技术。设备的预消毒和一次性使用特性可消除在过滤前或过滤后的消毒操作。这就避免了准备腐蚀性/消毒溶液和储存腐蚀性溶液的袋子/罐的需要，从而节省了成本。中空纤维、单通过切向流过滤组件已经被用于达到高浓度。虽然经过预消毒，但由于缺乏间隔/搅拌，其需要加大膜的尺寸，以确保足够低的处理时间。使用预消毒的一次性TFF膜，可以使用给定的膜表面积而实现更快的工艺。这些一次性使用设备还可以绕过包括消毒和在线清洗(CIP)在内的步骤，极大地减轻了生物负荷和污染风险，并减少了工艺时间和劳动力成本。此外，与具有相同膜面积的可重复使用膜包相比，一次性膜包的成本更低，这使其成为临床开发的一个具有良好成本效益的选择。本研究比较了一次性使用设备及流路和可重复使用技术在处理高浓度DS时的性能。
关键质量属性(CQA)定义为可测量的化学和物理属性，以确保最终产品质量在可接受的范围内。应用PAT为UF/DF操作单元提供了显著的好处，因为它可用于确认具有所需CQA，如高分子量(HMW)物质和赋形剂浓度，并实现工艺一致性。这些方法也为最终使用反馈和前馈控制下游单元操作提供了路线图。在本研究中，我们使用UF/DF在洗滤后达到高浓度mAb，并通过离线、近线和在线检测方法来测量DF和UF2期间的赋形剂浓度。下图给出了用于同时监测多个产品质量属性的UF/DF在线取样装置的示意图。该策略可以动态优化工艺参数，如进料流量、达到平衡所需的洗滤体积数量、目标赋形剂浓度以及针对给定赋形剂浓度达到目标蛋白质浓度所需的UF程度。
UF/DF设置示意图。
本研究开发的PAT应用使用Waters Patrol，其包括一个超高效液相色谱(UPLC)系统，配有一个在线自动采样器以及一个针对近线使用的转盘。我们的实验室之前使用Patrol开发了多种分析方法，并证实了该仪器的通用性和稳健性。在本文中，基于制剂缓冲液组成，开发并优化了用于多个UF/DF单元操作的多种方法。例如，针对UF/DF过程的每个阶段优化了在线稀释方法，以使多个产品质量属性同时在动态范围内。由于UF/DF过程中HMW形成的高风险，特别是在更高的蛋白质浓度条件下，因此在该单元操作过程中监测HMW被认为特别关键。据我们所知，这是第一次使用在线体积排除色谱(SEC)方法，结合简单的紫外检测，同时准确地量化HMW产品纯度和多种产品赋形剂 (精氨酸和组氨酸)。这些SEC方法结合在线稀释法在GMP生产中有极大的潜力，以实现多种产品质量属性的过程监测。
详细的实验方法和结果，请参考原文。
超滤和洗滤
UF/DF实验使用Pellicon D 型筛网可重复使用膜包和Repligen一次性 E 型筛网膜包，截留分子量为30 kDa。实验使用的膜面积分别为0.2 m2 (2 ×0.1 m2一次性)、0.0264 m2 (3 × 0.0088 m2重复使用)、0.04m2 (2 × 0.02 m2一次性)和0.02 m2 (1 × 0.02 m2一次性)。膜包安装于Pellicon™ Mini 膜包夹具，力矩设置为20.0- 21.0 Nm，一次性膜包使用垫片，以确保防泄漏密封。新的重复使用膜包用0.5 N NaOH消毒30 min，而一次性膜包已用0.1 N NaOH预处理并保存。所有膜包产品先用20 L/m2的水冲洗，然后用制剂缓冲液冲洗以10 L/m2进行缓冲液冲洗。针对研究使用的两种mAb，使用两种制剂缓冲液。在每次实验中，纯化的mAb物料 (~10 g/L)在UF1期间先浓缩，然后进行5个洗滤体积的DF，最后进行UF2浓缩，以达到>150 g/L。在UF/DF运行后，用0.5 N NaOH循环30 min对重复使用膜包进行消毒，如果通量恢复大于80%，则视为可重复使用。在DF和UF2期间，间断地从UF容器 (截留液) 收集样品，并记录时间，分别对应于在线/近线mAb、组氨酸和精氨酸浓度的浓度检测。最终的质量平衡或收率占起始物料 (包括取样体积) 的85%以上。
实验中，离线蛋白质浓度检测使用结合Agilent Cary60 UV-Vis分光光度计的SoloVPE系统(Repligen)进行。检测在280nm条件下使用10个光程，无散射校正，并使用适当的蛋白质消光系数。曲线拟合的所有测量结果的R2> 0.999，10个光程中至少有9个符合拟合要求。
SEC PAT方法以及用于赋形剂检测的UPLC方法和结果，请参考原文。
一次性和重复使用平板膜包UF/DF的性能比较
研究比较了一次性平板膜包和可重复使用膜包在工艺时间、操作方便程度、产品质量参数、工艺参数（如通量和压力降(下图)）、以及消毒/在线清洗(CIP)要求方面的性能。由于避免了使用前消毒和使用后CIP的需要，安装/操作更容易，一次性TFF膜包可以节省人力和资本成本。总体而言，一次性膜包与可重复使用膜包的工艺性能和产品质量相当，而成本仅为可重复使用膜包的一小部分，这使得一次性TFF膜包成为连续应用的可行选择。
UF2过程中可重复使用TFF膜包、大及小规模一次性膜包的工艺参数(a)通量、(b)跨膜压(TMP)、 (c)纵向压力降(DelP)。由于流道/膜包几何结构可能存在的差异，0.1 m2的一次性使用膜包显示出最大的压力降和最高的通量。更高的通量与更高的压力降相关，随着浓度的增加，蛋白质粘度相应增加，纵向压力也随之增加。
我们使用15-min方法和近线分析，研究了洗滤和超滤过程中，与mAb1洗滤体积和蛋白质浓度相关的DF缓冲液中赋形剂浓度的偏差。SEC单体百分比%在DF和UF过程中均不随时间而变化，与mAb的趋势相似，表明分子在聚集方面是稳定的。赋形剂精氨酸和组氨酸在第4个洗滤体积时达到平衡浓度。由于Donnan效应，两种赋形剂的浓度都随着蛋白质浓度的增加而下降。考虑到赋形剂浓度的漂移与蛋白质浓度和电荷相关，通过UF/DF达到目标赋形剂和蛋白质浓度往往需要复杂的优化，需要多次迭代来确定适当的DF缓冲液组成、DV数量和蛋白质浓度。在开发过程中，将这些PAT方法与在线或近线分析结合使用，可在同一天提供可用数据，从而实现更快的迭代和更快的工艺优化。这种快速的数据周转与离线分析测试形成明显的对比，离线分析检测需要等待几天的时间，因为基于CAD（荷电气溶胶检测器）的方法需要大量的样品制剂操作和数据分析。
使用0.02m2一次性膜包进行的小规模UF/DF研究中的赋形剂精氨酸(Arg)、组氨酸(His)和mAb1纯度(SEC单体)浓度。PAT数据采用8-min SEC法，并与针对赋形剂（CAD）和单抗纯度的离线分析方法进行比较。用SoloVPE测定蛋白质浓度。将(a)洗滤与洗滤体积的关系以及(b)超滤与蛋白质浓度的关系绘制成图，可以清楚地看出(a)中赋形剂浓度增加的趋势，并在(b)中降低。
总结：在本研究中，我们评估了一次性TFF膜包在我们mAb的特定赋形剂制剂中达到超过200g/L高浓度的性能。在通量和纵向压力降方面，一次性TFF膜包的工艺性能与Pellicon 3D可重复使用膜包相当。最高达0.1m2的不同尺寸一次性膜包被用于证实工艺的可放大性。对于有限循环应用，如临床运行，预消毒的一次性TFF膜包可提供相当的工艺性能，且显著降低资本投入和安装成本。赋形剂浓度(组氨酸和精氨酸)和单抗纯度通过三种内部开发的基于SEC的PAT检测方法进行监测，这些方法针对在线和近线应用的易用性和自动化分析而开发并优化。在几个案例研究中，我们监测了DF和UF期间的赋形剂浓度，并分析了其与洗滤体积和蛋白质浓度的关系，结果与UPLC-CAD离线分析方法一致。因此，我们证明PAT方法对于在数分钟内追踪赋形剂和CQA(即mAb纯度)是稳健的。
原文：J.M.West, H.Feroz, X.Xu, et al., Process analytical technolgy for on-line monitoring of quality attributes during single use ultrafiltration/diafiltration. Biotechnology and Bioengineering, 2021, DOI: 10.1002/bit.27741.
Repligen TangenX®平板膜包工作原理
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