上游补料分批细胞培养的工艺强化
随着每个行业的发展，在优化和改进生产工艺方面都会面临持续的压力，以应对日益增长的市场需求、复杂性以及日益激烈的竞争，生物制药行业也不例外。生物药制造商会通过仔细评估其当前生产工艺和站点，以确定潜在的优化空间，从而借助各种合适的方式来实现工艺的强化，在提高生产效率、缩短时间线、降低占地、释放更高的灵活性的同时，降低商品成本，提高自身的竞争力，并增强患者对其产品的可获得性和可负担性。特别是在COVID-19大流行这样的紧急情况下，虽然生物制药行业已经证明了其快速开发疫苗和治疗药物的能力，但在各种不可预测且不断变化的情况下，制造商还需要在加快产品上市时间的同时，能够大幅提高产品规模，以确保供应。
细胞培养是绝大多数生物治疗药物上游生产的核心，细胞培养的强化是实现整体生物工艺流强化的首要任务之一，除了细胞系开发、培养基配方以及生物反应器工程设计等方面的改进外，培养方式的改变，特别是基于灌流技术的连续培养方式，相比传统批次或补料分批培养，已被证明可获得显著的优势。然而，尽管细胞连续培养或连续工艺已被行业显而易见地认为是未来生物工艺的发展方向，但补料分批工艺仍是目前行业的主流，特别是早期开发的很多目前已经进入临床试验后期或接近获批的产品，且针对此类产品，工厂建设也往往基于此进行，如何对其进行工艺强化，一直是行业探索的重点；而对于新产品，很多公司也会基于此前已建立的补料分批平台进行，以快速推进开发，直到因临床试验或商业化对产品数量的需求增加而出现供应限制时，开发商也将面临同样的强化需求。
基于灌流细胞培养技术也同样适用于补料分批工艺，其以相似的核心技术原理，但结合不同的操作或工艺设计，而实现上游培养的强化。常见的补料分批细胞培养工艺强化包括浓缩补料分批（CFB）、N-1灌流和高密度细胞接种、高密度细胞建库以及高产量收获（HPH）等。
浓缩补料分批（CFB）
浓缩补料分批(CFB)是一种能直接提高生物反应器产量的强化补料分批工艺。与长时间连续灌流工艺一样，CFB通过交替切向流(XCell ATF®)过滤装置实现培养基循环，但不同的是，其使用MWCO 50kD的中空纤维组件，从而同时截留活细胞和产物（如~150kD的单抗）。与传统的补料分批反应器相比，CFB反应器可以显著提高VCD和批次生产效率 (Yang等，2016)。
许多用户决定使用CFB来强化现有工艺，因为与从补料分批转换为长时间连续灌流相比，在CFB和补料分批之间的工艺转变相对要小。这意味着用户通常可以更容易地调整他们现有的场地基础设施，包括细胞培养车间和现有的生物反应器，以使用CFB，亦即，通过建立CFB来实现强化可能仅需要较少的投资。另外，在CFB反应器中，ATF将浓缩产物返回反应器，而不是将产物从反应器中连续移除。这意味着CFB用户在生产周期的最后从生物反应器中收获产品，就像他们使用的传统补料分批一样，即可降低与连续生产相关的批次定义挑战。当然，这也意味着CFB不能像灌流那样为敏感的产品模式提供同样的优势。
N-1灌流和高密度细胞接种
上游强化通常可通过消除生长步骤或减少N阶段生产生物反应器所需的生产天数来加快时间线。对于许多生产商来说，在N-1生物反应器阶段实施灌流，同时保持生产反应器的补料分批工艺是一个极有吸引力的混合选择。因为在选择强化技术时需要考虑多方面的因素，包括实施的便利性、对于增加的产品的下游处理能力以及管理更高的工艺复杂性的能力。提高生产生物反应器产能往往成本高且耗时长，因此改用N-1灌流可以减少在规模放大某一工艺时出现上游瓶颈的可能性。通常，N-1灌流结合高密度接种可以减少生产生物反应器多达5天的运行时间 (Castan, 2019)。
与包括动态灌流在内的许多其它强化方法相比，N-1灌流相对容易实现。它只需要很少的设备改变，而且通常可以采用在补料分批生物反应器中使用的同一细胞系克隆。此外，它也可以避免CFB中因高细胞密度而可能出现的收获挑战。
使用N-1灌流生物反应器也是一个降低设备占地的机会。通过在N-1生物反应器中连续培养获得高密度的细胞，相比同等或更大的N-1补料分批生物反应器，制造商可以为N阶段生产生物反应器产生更多的细胞(Xu等，2020)，或者更进一步，使用N-2或更早的种子罐灌流，消除多个后续种子罐。此外，如果使用多个N阶段反应器，高细胞密度还可以促进种子扩增链总数的减少，进一步减少生物工艺链的占地 (Biopharm Services, 2018)。鉴于其在站点成功中的整体作用，生物工艺的占地是工艺强化的一大目标。如果做得好，它可以使生物制造商最大限度地降低他们的工厂开销成本，提高空间利用率，并最小化GMP工厂中最昂贵的空间，如洁净室。拥有一个更小的生物工艺占地也允许公司迅速部署新的生产线或整个设施。
N-1灌流强化
N-2灌流或更早阶段的强化
此外，N-1灌流无需对培养基、N阶段生物反应器或下游工艺进行昂贵且可能困难的改变，就可以提高生产率并减少占地。根据一组研究人员的建模，N-1灌流可节省高达51%的成本 (Barna等，2020)。
从传统补料分批（工艺A，1000L规模）向富集N-1罐的强化补料分批（工艺B，1000L规模）继而向结合N-1灌流的强化补料分批（工艺C，2000L规模）的转变，N-1步骤更高的最终细胞密度可显著提高以补料分批模式操作的生产生物反应器的接种密度，从而显著提高滴度，相比工艺A，工艺B增加了4倍，工艺C增加了8倍，同时可维持相当的最终产物质量。（Xu., et al., Bristol-Myers Squibb, 2020）。
高密度细胞建库
高密度细胞库可以减少种子扩增过程中所需的生长步骤的数量，因为传统的过程通常从一个冻保管开始，需要长时间的解冻和扩增时间。结合其它一些参数，如最终生产生物反应器的体积，高密度细胞库可以减少种子扩增时间多达三分之一，节省10天或以上 (Horry等，2019)。高细胞密度培养技术也相对容易与其它强化结合，如长时间的连续灌流和浓缩补料分批。
降低种子扩增链的大小和复杂性是一种相对简单的工艺强化策略 (Wright 等，2015& Tao 等，2011)。高细胞密度冻存瓶/袋的安全存储提供了大量的时间线加速，同时，它也可以通过消除单个种子扩增链中的更多步骤来减少占地，特别是当袋子可以用于在种子扩增链后期直接接种生物反应器时。
对于追求灵活性的公司来说，高密度建库是一个有吸引力的强化选择。这是因为用于高密度细胞库的细胞株一般都适用于灌流和补料分批工艺 (Wright 等，2015)。高密度细胞库可以减少工艺开发工作，并允许制造商相对轻松地在各种工艺类型之间来回切换。
在生产规模条件下，传统 vs. 高密度细胞建库对接种液扩增的影响。高密度细胞建库在节省时间和简化上游单元操作方面具有显著的优势。高密度细胞建库可实现种子扩增培养的直接接种，从而消除上游种子扩增链中的多个培养扩增步骤，在大规模接种液扩增中，可节省高达9天的生产工厂时间，进而改进种子扩增步骤中的操作成功性（Tao, et al., BiogenIdec Inc, 2016.）
高产量收获
高产量收获在典型的补料分批达到峰密度后，使用XCellATF®细胞截留装置。新鲜培养基按设定的流速添加，同时开始收获产物。这可带来显著的产量提升和工艺收益。
HPH生产相同产物滴度的时间是传统补料分批的一半，或可在不增加额外时间的前提下，获得两倍的产物滴度。利用HPH和N-1灌流的组合，可在一半的时间内获得高达两倍的产物。选择此工艺可过渡到一个单步、封闭式系统，并消除需要高资本支出、非线性放大且不适合剪切敏感型应用的离心以及低通量、低处理量且需要费时费力的搭建操作的深层过滤。无论您的目标应用是单抗、重组蛋白、慢病毒、酶或疫苗，HPH都可以提高生产效率，更快地提供更多产品。
补料分批工艺强化的赋能技术
– XCell ATF®
XCell ATF® 系统基于率获嘉奖的交替式(ATF) 技术，其通过泵头内隔膜的上下移动过程而形成，泵连接至过滤器外壳，后者再连接至生物反应器。交替式切向流通过隔膜泵的作用而实现。
XCell ATF®系统具有稳健的软、硬件集成，可为上游强化提供完整的解决方案。系统提供一次性使用和不锈钢两种形式，以及从实验室规模(2L)到工艺规模(5000 L)的尺寸。每套系统组成包括XCell ATF®设备、XCell™ 控制器、软件、管路和传感器。
Repligen在ISO9001质量管理体系下开发和生产用于生物制药行业的产品。我们专注于及时交付高质量、一致且稳健的产品，以确保我们客户的业务连续性。
参考文章：
Barna, J.,Horry, H., Rank, D., A Cost Analysis and Evaluation of Perfused Seed TrainScenarios Through Process Modeling. 2020, https://www.bioprocessonline.com.
BiopharmServices.The Top-Level Value of N-1 Perfusion Processes for 100-1000kg/yrBiologics Manufacture. Biopharm Services Blog. 2018, from https://www.biopharmservices.com/.
Tao, Y.,Shih, J., Sinacore, M., et al., Development and implementation of aperfusion-based high-cell-density cell banking process. Biotechnology Progress,2011, 27(3), 824-829.
Wright, B.,Bruninghaus, M., Vrabel M., et al., A Novel Seed-Train Process: Using High-DensityCell Banking, a Disposable Bioreactor, and Perfusion Technologies. BioprocessInternational. 2015, from https://bioprocessintl.com.
Castan, A.Ohrvik, H., Nelson, D. Next-Generation Bioprocess Techniques. GeneticEngineering & Biotechnology News, 2019, 38(15).
Horry, H.,Sieck, J., Krachtus, T., et al., Shifting The Biomanufacturing Paradigm:Intensifying Upstream Processes.2019, https://www.bioprocessonline.com/.
Xu, J.,Rehmann, M.S., Xu, M., et al., Development of an intensified fed‑batch production platform with doubled titers using N‑1 perfusion seed for cell culture manufacturing. Bioresources and Bioprocessing,2020, 7, 17. doi:10.1186/s40643-020-00304-y.
Yang, W. C.,Minkler, D. F., Kshirsagar, R., et al., Concentrated Fed-Batch cell culture increasesmanufacturing capacity without additional volumetric capacity. Journal ofBiotechnology, 2016, 217, 1-11. doi:10.1016/j.jbiotec.2015.10.009.
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