用于细胞和基因治疗的质粒DNA的下游纯化工艺
生物制药行业对 GMP 级质粒DNA（pDNA）大规模生产的需求从未如此强烈。供不应求的原因一方面是在COVID-19 mRNA疫苗成功推出的驱动下，行业对开发基于mRNA的疫苗和治疗药物的热情空前高涨，而其需要pDNA作为mRNA体外转录过程的起始材料。另一方面基因治疗和基于基因修饰的细胞治疗的大幅增长，其通过将治疗性基因递送到目标细胞中，以替换、添加或修饰问题基因，而病毒载体是目前最有效的基因递送工具，如腺相关病毒和慢病毒载体，其中，pDNA是通过宿主细胞瞬时转染方式生产此类病毒的关键原材料。
整体来看，GMP级pDNA作为具有严格质量属性的高度专业化原材料正越来越多地用于各种生物工艺，以确保这些治疗药物的高效生产。分析显示，未来五年，病毒载体和质粒DNA 制造市场的收入复合年增长率将达到18.7%，到 2025 年，全球市场规模将达到 8.453 亿美元。
但随着对GMP级pDNA质量和产量需求的提高，对制造商的挑战也在不断加大，要求他们创造必要的能力和资源，以满足对高质量pDNA不断增长的需求。GMP生产总体上是一个成本更高的过程，因使用的原料产品纯度更高，价格也更高，且需要专门的生产区域（例如洁净室），清洁方法需要验证，最终的GMP 产品纯度要求也更高，这需通过一系列经过验证的分析方法进行证实。
而对于pDNA的生产而言，因为尺寸较大、对剪切敏感、负电荷高、粘度高以及pDNA与生产过程中存在的杂质（如开环pDNA、基因组DNA、高分子量RNA）之间的相似性，而面临额外的挑战。从 1 kg湿生物质中回收的 pDNA 的平均量为0.5 - 1.0 g终产品，因此应对生产挑战、以满足大规模需求，对于实现提高效率和节约成本的解决方案至关重要。
为了获得良好的pDNA产量，最好的方案是拥有一个稳健的整体工艺，其中每个步骤都得到了很好的优化，而一个良好优化的下游工艺对于以高产率纯化超螺旋pDNA - 治疗/转染的理想形式 – 至关重要。Repligen为pDNA下游工艺的多个步骤提供独特解决方案，以确保最佳的 pDNA 产量和纯度。
细胞收获
细胞收获步骤通常使用离心或切向流过滤（TFF）。当需要处理批次体积较低（如<10 L）时，离心可能操作更简便，但使用离心时，需要特别注意运行产生的高剪切力，且一般认为离心方法较难规模放大。切向流过滤可以使用中空纤维组件，其为进样料液创造了一个温和的流动路径，降低剪切影响，并可用于处理高粘度和/或高固含量的料液。膜MWCO可选择500或750kD，其大小可有效截留细胞。TFF收获步骤通常包括 2-5X体积浓缩，然后是 3-5X体积洗滤，用于在进一步下游纯化之前洗掉培养基成分和细胞外杂质。TFF收获通常在较低跨膜压 (TMP，3–5 psi) 条件下操作，并通过滤液泵控制滤液通量，即以恒流模式操作，以减缓膜污染。
细胞裂解
用于细胞裂解的方法可分为两大类 - 化学（包括碱、去污剂、酶裂解）和物理性机械裂解。碱裂解（pH ~12 的 NaOH）伴随去污剂-如十二烷基硫酸钠 (SDS) 和Triton® X-100 -是最常见的方法。裂解孵育时间的优化很重要，其可直接影响pDNA的质量和产量。较长的孵育时间可能导致pDNA的不可逆变性以及基因组 DNA 的剪切降解。在碱裂解步骤中使用有效但不太激烈的混合至关重要，以确保没有导致质粒不可逆变性的极端pH值或由于过度剪切而降解的情况。裂解步骤的最佳pH值因质粒和宿主菌株的类型而异，与最佳值的偏差超过 0.1 个 pH 单位都有可能会影响产量，因此在碱裂解过程中保持对pH的严格控制至关重要。
澄清
pDNA 工艺的澄清单元操作应该能够从进料料液中去除固体成分。澄清可以通过离心和/或深层过滤进行。传统上，离心更多用于澄清。使用离心时，应注意剪切力，因其可能会破坏超螺旋质粒的结构，导致产量降低。离心后料液可能还需要二级澄清。使用深层过滤进行澄清是更为现代的方法，但可能需要特定方式的预处理，所以工艺开发时，必须仔细选择并考虑工艺的可放大性。
切向流过滤
澄清后，一般需进行 TFF 步骤，这将允许进行浓缩并通过洗滤将介质置换成适合下游层析步骤的缓冲液。通过在层析之前进行浓缩，也可以减少层析上样时间。此外，在TFF 期间可以去除 RNA、较小的基因组 DNA 和蛋白质，这也有助于防止层析填料污染。进行TFF操作时，需注意pDNA的剪切敏感性，应仔细选择TFF配置（包括膜组件形式和泵选择等）并调整工艺参数，以防止损坏质粒。高盐缓冲液可能导致pDNA压实而进入膜孔，导致产量损失。膜MWCO的选择因待处理的pDNA的大小或碱基数而异，一般为30-300kD，经验法则是选择MWCO规格比待截留的目标产物小3-5X，例如对于5-20kb的pDNA大小，100kD是推荐的实验起点。工艺过程中TMP通常维持在<10psi的较低水平，通量可达30-50LMH。
Repligen提供基于不同过滤器形式（中空纤维和平板膜包）、不同泵形式（蠕动泵、隔膜泵、磁力离心泵）、不同使用策略（一次性和重复使用）的切向流过滤解决方案，且从规模缩小工艺开发到规模放大临床试验及商业化生产的一系列系统均具有完整的数据记录以及辅助分析功能，并可根据生产环境GMP要求进行配置，从而满足不同开发阶段的要求。
从工艺开发到商业化生产的切向流过滤系统
层析
大多数现有的大规模纯化工艺都包括层析步骤，其基于单独或组合使用具有不同原理的层析模式，而提供了相对较高的分离分辨率。常用的pDNA纯化层析方法包括阴离子交换层析 (AEC) 和疏水作用层析 (HIC)，两种技术都有被用于捕获或中间体精纯，并且经常结合使用。AEC 可以去除蛋白质、低分子量 RNA和内毒素，但其效率高度依赖于受样品预处理和来源影响的样品组成。HIC能够将天然超螺旋 pDNA 从 pDNA 异构体、疏水性更强的核酸杂质 – 如RNA、基因组 DNA、变性pDNA – 以及内毒素中分离出来。下游纯化方案中有时也会包含体积排阻层析(SEC) ，但由于吞吐量较低且过程较慢，通常作为最后一步。pDNA分子对层析的挑战在于，常见的填料通常是针对蛋白质而设计的，而pDNA相比要大得多，因此可能不能有效进入孔隙，导致结合载量低、传质缓慢。层析的其它挑战包括回收率低、由于pDNA溶液的高粘度而导致的高压力降以及较长处理时间、对异构体分辨率低和潜在的污染挑战。
Repligen的OPUS®预装层析柱是一个开放平台，可由用户定义层析柱规格，且可预装几乎所有常见层析填料。OPUS®预装柱提供从工艺开发到临床以及商业化生产的完整规格范围，有助于实现平台化，且其具有良好的兼容性，可使用ARTeSYN®一次性层析系统以及所有行业标准层析系统。ARTeSYN®一次性层析系统专为全自动cGMP操作应用而设计，采用易于使用的一次性使用流路，结合专利的阀门设计，可降低残留体积，同时实现精确的梯度控制，优化工艺收率，同时，系统可全面兼容10cm- 80cm OPUS®预装层析柱，加快实施。
ARTeSYN®一次性层析系统及OPUS®预装层析柱
终浓缩和除菌过滤
层析分离后，样品在所选缓冲液中浓缩和洗滤。操作与层析前TFF的条件大致相同。而对于除菌过滤，由于终产品较大的尺寸和高粘度，且可能对剪切力敏感，会有额外的挑战，一些关键的考量因素包括盐浓度、膜类型、pDNA纯度以及如何定义过滤终点等。
pDNA质量检测方法
pDNA 的质量和纯度对于成功转染等后续应用至关重要。为了确定质量，一般的评估项目和方法包括基于OD260nm的DNA 浓度分析、基于OD 260/280nm的DNA纯度分析、基于鲎试剂的内毒素分析、渗透压分析、基于琼脂糖凝胶电泳或qPCR的残留基因组 DNA分析、基于琼脂糖凝胶电泳的残留 RNA以及基于HPLC 或通过琼脂糖凝胶电泳的ccc单体含量分析等。
相比传统分光光度计，Repligen基于斜率光谱法的SoloVPE®设备可显著提高灵敏度。SoloVPE®及其专用软件允许在260nm和280nm处同时检测，结果自动报告。用于确定pDNA纯度比的SoloVPE® UV光谱法已被证实是一种重要的分析工具，可加快极具挑战性的样品的检测，提供即时的反馈，作为快速、可重复且更准确的检测方法，已成为GMP生产中的标准检测技术之一。
SoloVPE®系统
（相关阅读：使用Slope Spectroscopy® (斜率光谱法) 检测基因治疗产品中的质粒DNA纯度比）
总结
目前，对治疗肿瘤、遗传性疾病和其它传染病的新疗法的需求正在上升，而不断增加的细胞和基因治疗管线以及越来越多的候选产品进入后期临床开发以及接近商业化，已经导致了pDNA 生产和供应的瓶颈，对可重复、高质量和可定制生物工艺材料的需求预计将在近年内继续保持增长，行业需寻找一种在保持高质量标准的同时、提高生产能力的方法，以解决这一独特的挑战。
微生物生物工艺的最新发展为制药行业，尤其是疫苗和治疗性蛋白质制造商，提供了具有适当规模和质量等级的专用解决方案，并具有足够的灵活性来帮助简化这些过程。建立冗余产能，以提高对供应链完整性和稳定性的信心，是Repligen在后COVID-19时代的一项关键举措，旨在确保最终用户可以不间断地采购关键生物工艺组件，从而快速且经济高效地执行生物工艺。凭借从工艺开发到大规模商业化生产的成熟解决方案的组合，我们可在确保高质量的情况下，为您的下游工作流带来工艺强化。
参考文献：
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A.R.Lara, O.T.Ramirez, Plasmid DNA Production for Therapeutic Applications. Recombinant Gene Expression, 2011, 271-303.
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