用于加快工艺开发的规模缩小灌流
全球单克隆抗体 (mAb) 市场规模预计将从 2021 年的 1,687 亿美元增长到 2022 年的 1,881.8 亿美元。2026 年mAb 市场预计将达到 2,922.2 亿美元。目前，行业仍广泛使用批次和补料分批进行mAb的生产。然而，显然需要更快、更高效且更具成本效益的工艺来跟上全球对 mAb 的需求。灌流策略已经存在了很长时间，但以往认为的高成本和低收益导致该技术的实施进展缓慢。该技术在过去十年中得到了迅速发展，这意味着现在其好处已经超过了所涉及的高成本，灌流方法现在在整个行业中得到更广泛的采用。除此之外，还有一个重点是从批次生产向连续生产 mAb 模式的转变，涵盖上游灌流工艺到下游连续层析。灌流工艺是将上游工艺从补料分批模式转变为连续模式的关键步骤。然而，要充分实现灌流和长期细胞培养工艺的全部好处，需要开发和优化灌流策略。低成本的小规模灌流策略通常难以执行，因为涉及的许多手动操作会增加污染风险。在这里，Techno Plastic Products (TPP) 的Tubespin Bioreactor Tubes（生物反应器管） 使 Menarini Biotech 能够以规模缩小模型评估灌流工艺，并与实验设计 (DoE) 建模一起加速长时间灌流工艺的开发。
通过交替式切向流 (ATF) 进行灌流
交替式切向流中空纤维一次性组件彻底改变了连续生产的潜力。中空纤维过滤器组件经过精心设计，可通过真空泵的交替作用对细胞产生低剪切应力效应，从而实现灌流的好处。如图 1 所示，ATF 中的液流运动由操作隔膜的真空泵驱动。隔膜将细胞悬液从生物反应器拉入中空纤维组件。中空纤维由孔径 0.22 μm的膜制成，因此无细胞收获液可透过膜并通过收获管路移除。然后隔膜将细胞悬液推回生物反应器，反冲洗动作清洗过滤器- 防止污染。因此，ATF 方法非常适合长期细胞培养工艺。
图 1：ATF 技术的机制可以减少由于反冲作用而对细胞悬液造成的剪切应力。
为了评估这些潜在优势如何与Menarini Biotech的平台工艺和细胞兼容，进行了技术演示，并在灌流模式下设置2 L 一次性生物反应器 (SUB) ，与补料分批模式下的 2L SUB 操作并行运行。该工艺在下面的图 2 中进行了概述。
图 2：灌流概念验证实验的工艺参数
表 1：Menarini Biotech 现有的补料分批平台工艺与 ATF 强化灌流工艺的比较结果
图 3：补料分批和灌流工艺的活细胞计数 (VCC) 和活性
实验的主要结果如表 1 所示。灌流工艺使平均特异性生产率 (qp) 略有增加，而累积产品增加了 2.5 倍，同时保持了所有必要的关键质量属性 (CQA)。这表明产物的增加是由细胞密度的增加引起的，而不是细胞特异性生产率的增加。这一点再次显示为活细胞 (IVC) 积分增加了 3.25 倍。
到生产的第 14 天，灌流生物反应器已产生与 17 天的标准补料分批运行相同数量的 mAb。然而，到第 17 天，来自灌流生物反应器的累积 mAb 产物与标准补料分批运行相比增加了 2.5 倍。在灌流的最后 3 天，生物反应器能够生产 1.5 倍于标准补料分批工艺的产品。这证明着灌流作为一个长期过程的好处，并突出了在连续生产方面的巨大前景和潜力。不过，长时间运行这样的生产工艺可能会对细胞产生未知的影响，因此需要彻底开发和优化该工艺。
灌流工艺有许多特定的操作因素，包括但不限于：
培养基交换率 灌流培养基 细胞特异性灌流速率（CSPR） - 可以观察或设置 灌流开始日
为了筛选这些参数之间的相互作用并在成本和生产率方面优化工艺，即使使用 DoE 方法，也需要进行许多实验。这可能需要大量的资源和人力的投入。为了优化生物反应器中的条件，需要昂贵的自动化设备。相反，Menarini Biotech 确定了一种使用 Techno PlasticProducts (TPP) Tubespin 生物反应器管的廉价方法，以进一步优化 DoE 筛选实验中的灌流参数。
通过 TPP TUBESPIN 生物反应器管进行灌流模拟
TPPTubespin 生物反应器管，如图 4所示，是无菌的通气离心管，允许通过 0.22 μm通气盖进行气体交换。锥形设计允许细胞在生产容器中离心- 通过减少将培养物转移到离心管的步骤来降低风险。这对于灌流规模缩小至关重要，因为这意味着可以通过去除营养耗竭的上清液并每天更换新鲜培养基，来实现灌流模拟系统。但重要的是要注意，这是一种灌流模拟，而不是直接的规模缩小，因为与生物反应器中的灌流方法不一样，培养基置换也不是恒定的。然而，TPP Tubespin 生物反应器管中的实验设置是使用 DoE 方法设计的，通过将所有管置于相同条件下来识别有意义的差异。此外，文献报道和我们的工作表明，TPP Tubespin 生物反应器管适用于长期灌流。
图 4：A) TPP Tubespin 管的可放大性 B) 0.22μm过滤帽允许哺乳动物细胞直接在摇管中培养。
研究进行了一项实验，以对TPP Tubespin 生物反应器管与 125 mL 摇瓶进行比较。主要结果如下：
如图 5 所示，VCC 和活性结果显示出在摇瓶和 TPP Tubespin 生物反应器管中具有几乎相同的趋势。 因此，这可以准确地表示灌流工艺，并可用作加速灌流工艺优化的规模缩小模型。 如图 6 所示，在 TPP Tubespin 生物反应器管而不是生物反应器中进行实验可节省 2 个月的时间。
图 5：补料分批和灌流工艺的 VCC 和活性
图 6：使用 TPP Tubespin 生物反应器管加速工艺开发
用灌流模拟 DOE 筛选灌流参数
设置筛选实验以研究在 TPP Tubespin 生物反应器管中灌流长达 27 天的长期影响，如下所述：
表 2：灌流 DoE 筛选实验中要研究的因素
图 7：A) 活性等值线图 B) 累积产品等值线图 C) COG 等值线图
使用Umetrics MODDE v13 DoE软件对数据进行分析，结果如上图7所示。为最大化累积产品和细胞活性以及最小化成本而确定的优化参数如下：
较晚开始灌流 低补液百分比 高 VVD 中等接种密度
结果显示灌流运行 27 天的净改善如下：
17天内的产品数量（类似于 2 L SUB 数据）是补料分批的 3 倍 27天内的产品数量是补料分批的 7 倍 每mg产品成本比补料分批减少 80%
结论
由于去除了有害代谢物并补充了基本培养基成分，灌流对生产单克隆抗体的细胞培养具有显著的积极作用。在抗体的总滴度和每克抗体产生成本方面观察到了进一步的好处。 在生物反应器中建立高通量自动灌流规模缩小模型成本高昂，需要资源和人力投入。与生物反应器相比，TPP Tubespin 生物反应器管提供了一种降低污染风险和时间线的低成本替代方案。 Menarini Biotech成功使用TPP Tubespin 生物反应器管在短时间内筛选了灌流参数。TPP Tubespin生物反应器管将用于进一步优化工艺。
原文：Z.Heighes, V.Saxena, D.Gbeddy, et al., Scale-down perfusion foraccelerated process development, 2022.
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