CELL解密！张春立团队运用谱系追踪法重新审视小鼠体内胶质细胞向神经元转分化现象
神经元丢失一直是各种神经退行性疾病和损伤面临的重大问题。如何补充这些功能性神经元成为治疗的难点。近年来科学家们通过基因操纵在哺乳动物体内实现了诱导神经元再生，为治疗神经元丢失相关的疾病提供了良好的基础。
其中最令人兴奋的是通过AAV载体过表达NeuroD1或者敲低Ptbp1达到了近乎完美的 “体内星形胶质细胞向神经元转分化” 成果。而这些快速诱导产生的神经元展现出了惊人的潜力，不仅其自身形态，电生理特性，组织排列与内源性神经元近乎一致，还修复了胶质瘢痕，对脑中风，帕金森综合症，亨廷顿舞蹈症等疾病表现出显著的治疗效果。这种 “胶质细胞转分化” 现象在灵长类动物中也可观察到并且即将应用于人类。
在这样激动人心的时刻，神经再生领域的科学家们认为最值得推敲的，仍是这些近乎完美的神经元是否真的来源于胶质细胞转分化。
北京时间2021年9月27日晚23时，美国得克萨斯大学西南医学中心的张春立团队在Cell上发表了题为“Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo”的文章，是继科学家们开辟了体内原位神经再生法后，首次重审小鼠体内胶质细胞向神经元转分化现象。
该研究运用谱系追踪法系统地证明过表达NeuroD1或敲低Ptbp1并不能把体内星形胶质细胞转分化为神经元。那些所谓的“新生神经元” 只不过是大脑本身的原位神经元。
由于一直以来对这些近乎完美的“星形胶质细胞转分化为神经元”的质疑，作者设计并重复了先前关于NeuroD1介导神经再生的实验结果。他们将同时携带报道基因mCherry（一种红色荧光蛋白）和NeuroD1的AAV载体注射到小鼠大脑皮层，在感染后的第4天发现报道基因主要在星形胶质细胞中表达；然后在17天检测时则发现对照组的报道基因仍然集中于胶质细胞，而NeuroD1组的报道基因看似主要存在于神经元中，也就是先前报道中所认定的 “新生神经元”。然而当作者看到了如上帝之手创造的近乎完美的“新生神经元”之后，不禁对此产生了质疑。因此他们设计了一系列实验来进一步验证这些惊人的结果。
首先在病毒载体注射后的4天到17天的时间段内，作者没有观察到胶质细胞向神经细胞转分化的中间体，比如双生素DCX标记的未成熟的神经元。另外作者应用脑外伤模型引起局部胶质细胞激活和增殖并利用BrdU对激活的胶质细胞进行标记（由于BrdU能在细胞分裂时插入正在复制的DNA片段，因此不会标记内源性的神经元），并未发现NeuroD1组报道基因标记的神经元细胞来源于损伤激活的胶质细胞。
接下来作者将Aldh1l1-CreERT2与R26R-YFP杂交产生了用YFP（一种黄色荧光蛋白，可被绿色荧光蛋白GFP抗体识别）示踪大脑星形胶质细胞的由他莫昔芬诱导的老鼠品系。这种品系在大脑皮层中标记了大约95%左右的星形胶质细胞。虽然在这种老鼠中仍然观察到NeuroD1组的报道基因mCherry在神经元中，但他们并没有携带YFP信号，说明不是来源于大脑胶质细胞。即使在脑损伤存在的情况下，也没有找到能被谱系追踪的“新生神经元”。这些结果再一次质疑和否定了NeuroD1介导的“新生神经元”来源于胶质细胞。
由于先前研究中曾运用到Cre-FLEX系统来实现基因在某种细胞中的特异性表达，作者也将此系统运用到NeuroD1的验证工作中。然而发现，如果所需的Cre酶表达来源于示踪胶质细胞的谱系老鼠，相应的实验窗口中根本无法观测到报道基因mCherry阳性的“新生神经元”。只有当Cre酶存在于AAV载体上时才产生“新生神经元”现象。而这种由AAV来实现胶质细胞特异性表达Cre酶的方法本身就是不严谨的。作者通过系统性的实验，证明了AAV载体表达的Cre酶具有偏向性的在神经细胞中表达。因此运用AAV 载体的Cre-FLEX系统证明胶质细胞向神经元转分化本身就缺乏可靠性。
那么NeuroD1介导的近乎完美的“新生神经元”到底是什么来源呢？作者非常怀疑它们是本来存在于大脑中的内源神经元。因此作者巧妙地设计了预先标记原位神经元的方法：将携带GFP（绿色荧光蛋白）的retroAAV打到小鼠脊髓部位，使其通过轴索进入大脑皮层的一部分运动神经元（其轴索延伸在脊髓的白质部分）从而在这些细胞中表达GFP报道基因，同时这种方法可以百分之百避免标记任何脑部的胶质细胞。惊人的结果出现了，在这种系统里，作者发现了大量的NeuroD1介导的mCherry阳性的神经元与GFP事先标记的内源性神经元重合！这项结果有力地证明NeuroD1介导的所谓“新生神经元”实际上是内源性神经元。
为了进一步探索NeuroD1诱导产生这种假象的原因，作者进行了一些初步的探索，对NeuroD1基因进行改造，产生了一些NeuroD1突变体。作者在体外实验中验证了改造后的NeuroD1突变体不能诱导U251胶质瘤细胞向神经细胞分化。然而再次令人惊讶的结果是，这样丧失能力的NeuroD1突变体仍然在体内具备诱导产生“新生神经元”的假象。到此，多项实验结果证明NeuroD1本身不具备诱导体内原位胶质细胞向神经转分化的能力，那些近乎完美的“新生神经元”本身就是内源性的神经元细胞。
除了过表达NeuroD1以外，去年Nature和Cell都报道了在胶质细胞中敲低Ptbp1能够实现小鼠体内胶质细胞向神经元转分化并在帕金森疾病模型中展现出治疗效果。作者对这两项研究中的结论也进行了验证和推敲。首先，运用Cell报道中CasRx介导的基因敲降方法，他们发现内源Ptbp1并没有很好地下调，也未观测到谱系标记的胶质细胞转化为神经元。其次，通过shRNA介导的基因敲降方法，作者可非常有效地敲低内源Ptbp1但同样也没观测到谱系标记的胶质细胞转化为神经元。在这些研究中，作者运用了两种谱系追踪鼠系和多种AAV，结果都一致证明敲低Ptbp1并不能将小鼠体内胶质细胞转分化为神经元。
综上所述，作者运用严格的谱系示踪法阐述了NeuroD1过表达并不具备体内诱导胶质细胞转变为神经元的能力，同时确凿地证明了先前被认定的“新生神经元”实质上就是大脑中的原位神经元；另外体内敲低Ptbp1也不能实现胶质细胞转分化。至此，该研究不仅对神经再生领域的种种质疑提供了答案，同时为今后该领域的研究也提供了更加严谨的把关方法，为今后的研究指明了道路。
美国得克萨斯大学西南医学中心分子生物学系instructor王蕾蕾和博士后Carolina Serrano为文章的共同第一作者，王蕾蕾和张春立教授为共同通讯作者。张春立实验室的钟小灵博士和马帅鹏博士以及实验室管理员邹玉华也对该研究做出了重要的贡献。付向东本人及其实验室的钱浩博士为该研究提供了必要的AAV载体。
张春立实验室正在招聘博士后，研究方向是胶质细胞的可塑性及其在神经损伤和退行性疾病中的作用。
有意应聘者请投简历：
Chun-Li.Zhang@UTSouthwestern.edu
https://profiles.utsouthwestern.edu/profile/29691/chun-li-zhang.html
相关论文信息：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.005
编辑 | 余 荷
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