江湖论剑---iPSCs技术在细胞免疫治疗中的应用
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万里归来年愈少，微笑，笑时犹带岭梅香。
试问岭南应不好？却道，此心安处是吾乡。
----苏东坡
诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells）（相关文章期待本公众号下期文章《煮沸的孟婆汤---诱导多能干细胞》），是指将已分化普通成体细胞（诸如皮肤）通过转入一些基因（最早是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4这四个），使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。在技术江湖中称 iPSCs。
在2006年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）带着他的徒弟，从24个基因开始筛选、持续组合，终于找到4个基因（Oct4，Sox2，Klf4 和c-Myc），用逆转录病毒转染至普通体细胞中，让细胞表达这些基因，于是体细胞的表达系统被再编程，出现了胚胎干细胞样的细胞，具有分化成各类成体细胞的潜能，这就是诱导多能干细胞（inducedpluripotent stem cells，iPS cells，iPSCs）。山中伸弥也因此斩获了2012年的诺贝尔生理学或医学奖。
iPSCs的优势是克服了免疫排斥，解决了细胞来源量的问题，也止住那些用社会伦理，抵制破坏胚胎取得干细胞的舆论！这确实是一个飞跃。
用iPSCs 技术的发展与优化
（1） 从“传统转录因子”到“小分子化合物”
Meltonetal团队研究了丙戊酸（组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的一种抑制剂）的作用，他们发现其可以提高重编程效率100倍（相对于山中伸弥“四因子法”）。于是提出，丙戊酸像转录因子c-Myc一样可引起信号通路的改变。同样，类似的补偿机制出自于对Sox2基因的模仿。在2008年，Dingetal团队研究了BIX-01294（组蛋白甲基转移酶（HMT）的一种抑制剂）的作用，然后将其结合在钙离子通道从而提高重编程效率。可以预见的是，此类研究是寻找更有效提高重编程的小分子化合物，发现由“重编程因子和重编程化合物”组成的鸡尾酒，从而有效和可靠地将体细胞重新编程iPS细胞。
（2） 寻找逆转录病毒的替代载体
寻找逆转录病毒的替代载体，如腺病毒、质粒和裸露的DNA等，可避免肿瘤发生，提高产率。先说腺病毒方法。2008年，Hochedlingeretal等利用腺病毒将4个转录因子转运到小鼠皮肤和肝细胞的DNA中，从而产生类似于胚胎干细胞的iPS细胞。2009年，Freedetal等证实人类成纤维细胞成功可被重编程为iPS细胞。腺病毒具有其它载体不具有的独特性，不会将自身基因整合到宿主细胞中，避免插入突变的潜在危害。腺病毒的另一个优点是，在短期见效，重编程效率高。质粒的方法呢，虽说避开了病毒载体，它仍需要对致癌基因进行重编程。而这主要问题是转染效率较低。
（3）其他
在仿生学的整体策略上，通过利用纯化蛋白将成体细胞重编程胚胎样细胞、诱导基因的筛选优化也是也是一个方向。Morrisey研究小组利用microRNA可将重编程效率提高100倍，microRNA是小分子RNA，它能够结合到信使RNA的互补序列，并抑制基因表达。
iPSCs技术在免疫细胞治疗的报道并不是很多，而且都集中在日本。2010年，日本理化研究所的科研人员在动物实验中，成功利用iPS细胞生成具有抗癌效果的特定淋巴球，并已确认这种淋巴球被输入患有癌症的老鼠体内并激活后发挥了抗癌效果 。
2015年8月27日，发表在《Stem Cell Reports》杂志上的一项研究中，日本东京大学的Miki Ando等发现，iPSC-CTL细胞能够有效减小小鼠体内肿瘤体积，并且通过caspase-9(iC9)-based suicide system 能够有效诱导iPSC-CTL在体内的凋亡，以提高治疗的安全性。
2015年10月27日，由东京大学教授DAVID L. HERMANSON等研究者在《Stem Cell》发表了用IPSC-NK治疗卵巢癌模型小鼠的文章：利用人体iPS细胞制备出IPSC-NKcells，再将IPSC-NK cells注射入患有卵巢癌的小鼠腹腔，并且将人外周血NK cells和IPSC-NK cells进行对比，发现后者的治疗效果好于前者。
图一：人外周血NK和IPSC-NK对乳腺癌高转移细胞（MA-148 ）感染的癌症小鼠模型的杀伤对比试验
图二：人外周血NK和IPSC-NK对卵巢癌细胞系（A1847）感染的癌症小鼠模型的杀伤对比试验
图三：小鼠总生存率的卡普兰-迈耶曲线对比表
2016年2月9日，日本京都大学Shuichi Kitayama等将Vα24不变的自然杀伤T（iNKT）细胞通过基因重编技术转化成为iPS细胞（诱导多能干细胞），随后再将这种iPS细胞再分化成为表现其它类型特性的重编程iNKT细胞，这些新编程的iNKT细胞在体外通过IL-7 /il-15-based优化细胞因子组合的扩增，具有很强的细胞增殖和IFN-γ的分泌能力，还能诱导树突状细胞的成熟和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和NK细胞活化，对癌细胞的表现出很强的杀伤作用。
应用iPS细胞大规模生产NKT、NK甚至CAR-T等免疫细胞，一是不局限于癌症患者身体原因（如患者本身年纪、感染性疾病、放化疗等导致的免疫过于低下等）。二是便于做到标准化、规范化生产，形成通用型免疫细胞。三是便于针对患者进行不同剂量、不同疗程的治疗，以达到更好的治疗效果。为了要达到此目的，我们要解决iPS细胞重编程技术的安全性问题，解决向NKT \ NK等细胞的分化技术，还要考虑异体使用免疫细胞的排异反应。介于技术的复杂性、国内政策的不确定性，笔者认为近10年内还是很难看到iPS技术的成熟产品问世。但是笔者也相信，不论10年也好，15年也罢，必定有一批为之努力的技术人员、临床人员在这条路上摸索前行，前赴后继！
那些年，曾经咀嚼过的一点文献：
Huangfu D,Maehr R, Guo W, et al. (2008)“Induction of pluripotent stem cells by definedfactors is greatly improved by small-molecule compounds”. Nat Biotechnol 26(7): 795–797.
Desponts,Shi; Desponts, Caroline; Do, Jeong Tae; Hahm, Heung Sik; Schöler, Hans R.;Ding, Sheng (November 2008) “Induction of pluripotent stem cells from mouseembryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds”. CellStem Cell 3 (5): 568–574.
Desponts,Shi; Desponts, Caroline; Do, Jeong Tae; Hahm, Heung Sik; Schöler, Hans R.;Ding, Sheng (2008). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonicfibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds”. Cell Stem Cell 3(5): 568–574
Zhou, Wi;Freed, Curt R. (2009). “Adenoviral gene delivery can reprogram humanfibroblasts to induced pluripotent stem cells”. Stem Cells 27 (11): 2667–2674.
"MajorStep In Making Better Stem Cells From Adult Tissue". Science Daily.2009-10-19. Retrieved 2011-05-23.
Judson,RL. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. ， May 2009，27(5):459-61 · .
1661-1667页
, Stem CellReports，13 October 2015，, p597–608
Inducedpluripotent stem cell-derived natural kill cell for treatment of ovarian cancer,stem cells Oct 27 2015. Pages 93–101
Cellular AdjuvantProperties, Direct Cytotoxicity of Re-differentiated Va24Invariant NKT-likeCells from Human Induced Pluripotent Stem Cells ，StemCell Reports，9February 2016,Volume 6, Issue 2, Pages 213–227
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作者：南山小仙
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