师说 | 胡红丽教授：以“镜”制“冻”，用冷冻电镜探索微观世界

前言

冷冻电镜是目前我们开展结构生物学研究的重要工具，为我们了解G蛋白偶联受体的结构和功能提供重要支持。

香港中文大学（深圳）生命与健康科学学院助理教授胡红丽博士将在本期“师说”采访中，讲述她的科研经历，以及何为冷冻电子显微镜技术。胡红丽博士是博士生导师、香港中文大学（深圳）科比尔卡创新药物开发研究院首席研究员。

胡红丽博士

胡红丽博士是我校生命与健康科学学院助理教授、博士生导师及香港中文大学（深圳）科比尔卡创新药物开发研究院首席研究员。胡红丽博士主要从事G蛋白偶联受体（GPCR）的复合物研究，运用冷冻电镜技术研究得到GPCR的高分辨结构，并研究膜蛋白与其调控蛋白之间相互作用，为设计以膜蛋白为靶标的药物提供重要的理论依据。

胡红丽博士先后获得南开大学应用物理学专业学士学位和北京大学医学部生物物理学专业博士学位，随后赴美国开展博士后的研究工作。她曾在美国纽约州卫生部Wadsworth Center、密歇根大学和斯坦福大学从事基于冷冻电子显微镜的结构生物学的研究。在密歇根大学和斯坦福大学从事科研工作期间，胡红丽博士与2012 年诺贝尔化学奖得主布莱恩·科比尔卡教授（Brian K. Kobilka）和罗伯特·莱夫科维茨教授（Robert J. Lefkowitz）进行了相关合作研究。胡红丽博士参与了许多重要科研项目，在解析G 蛋白偶联受体（简称 GPCR）高分辨的复合物结构方面有所建树。

胡红丽博士的主要研究成果包括阿片受体与抑制型G蛋白Gi的3.5埃高分辨电镜结构，以及首个C类GPCR代谢型谷氨酸受体（mGlu5）全长分子不同状态的电镜结构。自2017年起，她已在Nature、Cell 等顶级学术杂志上发表文章五篇，其中以共同第一作者身份在Nature发表了两篇文章，这两篇文章均被Nature News and Views着重报道。

Q1

您的学习经历是怎样的？因何开始冷冻电镜的研究？

我本科就读于南开大学应用物理系。应用物理学是一个交叉学科的专业，包括生物、医学、光电子信息科技和光学等方向。本科前两年，学习了物理学的基础课程之后，到大三细分专业方向时，我选择的是生物物理学方向，所以我在本科阶段就对生物学有了一定的知识积累。到大四的时候，我想继续从事科研。机缘巧合，北京大学医学部的尹长城教授来南开进行讲座，他当时讲的就是冷冻电子显微镜的技术，我听了之后很震惊，用冷冻电子显微镜技术居然可以直接“看”到需要研究的生物分子，我觉得这个技术如果发展起来会有非常广泛的应用空间。

在毕业设计的时候，我选择进到尹长城教授的科研组做实习，本科毕业后，尹长城教授也成为了我的博士生导师。我算是正式进入了冷冻电镜的研究领域。可以说，尹老师是我科研上的领路人。本科阶段我掌握的物理学，数学和生物学的交叉学科知识也帮助我从事冷冻电镜方面的结构生物学研究。

Q2

冷冻电镜技术是怎样发展起来的？

1931年，德国科学家Ernst Ruska发明了透射电子显微镜。上世纪中叶，生物学家尝试对生物样品进行固定、包埋、切片及重金属染色等技术应用电子显微镜观察细胞的精细结构，并发现了许多重要的细胞器。但是这样观察到的生物样品是脱水状态的，而且是对附着生物分子的重金属染料成像，无法获得生物大分子的高分辨结构信息。

上世纪80年代，Jacques Dubochet发明了快速冷冻的方法，可以将生物分子在溶液中的状态迅速固定。当降温速度比较快时，水溶液会形成无序的玻璃态冰，令生物大分子可以保持其在溶液中的原始结构，而低温环境亦可降低电子对生物大分子的辐射损伤，保持蛋白质的高分辨结构信息。这种用低温制备并观察样品的技术成为现在普遍使用的冷冻电子显微学技术。Jacques Dubochet也因为自己对冷冻电镜技术发展的原创性贡献，与Joachim Frank和Richard Henderson共同分享了2017年诺贝尔化学奖。

我读博士的几年是比较幸运的，见证了冷冻电镜领域最重要的几项技术变革。到今天，冷冻电镜与X射线、核磁共振并列为结构生物学的三大技术。

在硬件方面，厂家一方面在努力提高电子显微镜的机械系统和光学系统的稳定性，尤其是新开发的三级聚光镜的系统保证了电子束的相干性很好。另外一个就是样品台，之前都是人工操作，后来发展出来用机械手取代人工进行样品转移和放置，这样的好处就是更稳定，同时所有操作都与外界隔绝，可以避免样品受到污染。在图像采集方面，基于CMOS技术开发的直接电子探测器取代了CCD和胶片，可以对样品进行高速连续采样，大大地提高了探测效率。

在软件方面，英国剑桥大学的Sjors Scheres发明了单颗粒三维重构分析算法并将其开发为实用的软件RELION，对样品里面不同状态的颗粒的图片进行二维和三维的分类，有效将不同构象状态的结构通过分类区分。2013年，加州大学旧金山分校的David Agard和Yifan Cheng用冷冻电镜技术解析出了TRPV1近原子分辨率结构，至此，冷冻电镜进入一个全新的时代，众多过去无法解析的低分子量、无对称的重要生物大分子结构被解析出来。

Q3

您的科研经历是怎样的？

我在博士期间和博士后前两年做的都是钙通道蛋白的结构解析，一个是钙离子的释放通道，一个是电压门控的钙通道。我用这宝贵的几年时间学习了各种电子显微镜相关的理论知识和实践经验，为自己的科研工作打下了坚实的基础。

博士毕业后，我在Wadsworth Center从事冷冻电镜相关的博士后研究，是2017年诺贝尔化学奖得主Joachim Frank教授的实验室所在地。我的导师是Frank教授的学生——Terry Wagenknecht。我在Wadsworth Center学习了冷冻电子显微镜的另一项重要技术：电子断层扫描成像。后来实验室的导师退休，我找工作的时候联系了密歇根大学的Georgios Skiniotis教授。面试的时候，他比较看重我有丰富的冷冻电镜的科研经验。我进入实验室之后才知道他和获得2012年诺贝尔化学奖得主的两位教授——杜克大学的莱夫科维茨教授和斯坦福大学的科比尔卡教授有密切的合作。

刚进实验室，我就接手了一个GPCR复合物的课题。我去之前，实验室的两位博后已经做了一些尝试。这一类复合物分子量比较小，当时认为用冷冻电子显微镜解析结构还比较困难，复合物又非常不稳定，我们在制备冷冻电镜样品的时候一直遇到很多困难，我加入之后就和他们在样品筛选和制备方面做了很多实验，终于取得了一些进展。另一方面，当时世界上仅有少数实验室设置了自动数据采集软件来收集数据，我们还是用手动的方式，每张照片都要操控样品杆把样品移到中心，然后进行聚焦和曝光，往往收集一套数据要重复成千上万次，效率也比较低，即便24小时不休息，一天也只能照几百张照片。我就和导师提出要安装一个自动数据采集软件，把人力解放出来，他同意后我就结合之前学过的知识摸索如何安装和设置自动数据采集软件。

2017年初，我刚把密大的一台冷冻电镜的自动收集程序调试运行成功时，Georgios Skiniotis教授决定把实验室搬到斯坦福，以便和科比尔卡教授在斯坦福大学的实验室继续合作。当时斯坦福已经安装了四台冷冻电镜，但是软件和调试工作都没开始。Skiniotis教授说服我去斯坦福继续和他一起工作，包括让我负责电镜的软件安装和调试工作，希望把我在电镜技术上的积累和创新充分利用起来。

上图为胡教授2018年发表的Nature一作论文插图，原文引用为：Antoine Koehl*, Hongli Hu*, et al, “Structure of the μ Opioid Receptor-Gi Protein Complex”, Nature, 558(2018):547-552

这几年内，我和科比尔卡教授有诸多合作，其中有两个最有代表性的成果。第一个课题是关于GPCR和G蛋白复合物的，我们研究的是阿片受体，阿片受体是镇痛剂的靶点，它是通过结合G蛋白向下游传递信号的。科比尔卡教授课题组对阿片受体的工作机制的研究已经开展了很多年，他们用晶体学的方法分别解析了阿片受体蛋白在失活和激活时的构象，了解了受体激活过程的结构变化，但是不同的激动剂激活方式的区别以及阿片受体是如何选择性结合G蛋白向下传递信息，这些方面尚未有明确的答案。

当时，科比尔卡教授的一个博士研究生花了几年时间尝试结晶阿片受体与G蛋白的复合物，拿到了不少晶体，但是都没有衍射信号，所以他找我们合作，希望可以用冷冻电镜方法研究它的结构。这个工作是我在密歇根大学的时候开展的，我一边测试样品，一边测试自动收集软件。刚开始的时候，在薄冰中找不到蛋白颗粒，只能在厚冰处收集数据，图像衬度比较差，分辨率也很难提高。后来我们改进了制样技术，把复合物冻到很薄的冰层中，图像衬度比有很明显的提高，最后得到3.5埃分辨率的结构，可以非常精确地看到受体和G蛋白的作用位点。这项成果于2018年发表在Nature杂志上。Nature在同一期发表了另外三篇GPCR复合物结构相关的文章，在同期的四篇论文中，我们的分辨率是最高的。

第二项成果是Class C的GPCR的结构，这项成果也是非常有代表性的，因为Class C GPCR和其他类型GPCR差别很大。所有的GPCR都有七次跨膜螺旋，但Class C GPCR在胞外有个很大的结构域，而且它的正构位点（Orthosteric Site）不在七次跨膜区，而在胞外的结构域上。我们研究的代谢型谷氨酸受体5（简称mGlu5）是参与调节中枢神经系统的突触传递和神经元兴奋性受体，一般是以二聚体的方式行使功能。

科比尔卡教授课题组曾经用晶体学的方法做了很多尝试，只能得到胞外区的结构，使用全长的分子进行结晶得到衍射也无法算出跨膜区的结构，亦无法得知配体结合到正构位点之后是如何传递到跨膜区的。我们用冷冻电镜方法分别成功解析了mGlu5在失活和激活状态的两个结构，失活状态胞外VFT（捕蝇器）区域是张开的，二聚体也是几乎平行的。配体结合之后被VFT捕捉，然后VFT关闭，带动二聚体产生一个比较大的位移和旋转，跨膜区也随之距离变短，7次跨膜的构象也发生变化。我们用突变的方法验证了二聚体激活后的结合位点与mGlu5行使功能相关。这是首次观察到完整结构的C类GPCR的构象变化，这项成果在Nature杂志发表后，又有一篇短讯刊登在同一期杂志Nature News and Views，也在Twitter上引起众多转载。

上图为胡教授2019年发表的Nature一作论文插图，原文引用为：Antoine Koehl*, Hongli Hu*, et al "Structural Insights into Metabotropic Glutamate Receptor Activation". 

Nature, 566(2019):79–84

Q4

您为什么选择加入港中大（深圳）？

香港中文大学（深圳）科比尔卡创新药物开发研究院2017年成立的时候，我在美国就关注过，当时我的课题有了一些阶段性的成果，我还憧憬了一下将来可以来到这里工作。去年下半年，我的两个重要成果都发表之后，我开始认真考虑回国发展，第一个就想到了这里，拿到文章接受信之后我就开始准备面试。科比尔卡教授和他的夫人Tong Sun都非常支持我，去年11月的时候我就得到了面试的机会。

在和叶院长、朱宝亭教授等学校和学院领导深入交谈后，我更加深入地了解香港中文大学（深圳），感受到港中大（深圳）欣欣向荣的发展面貌。港中大（深圳）拥有良好的科研氛围和高水平的科研平台，香港中文大学（深圳）科比尔卡创新药物开发研究院引进了两台最高端型号的冷冻电子显微镜Titan Krios，并且配备了强大的计算机集群。学校和学院领导都很重视研究院的建设和发展，研究院的几位独立实验室负责人（PI）在科研背景上有很好的互补性，可以快速推动科研工作的进展，相信在港中大（深圳）生命与健康科学学院院长叶德全教授和科比尔卡教授带领下，我们很快会在药物开发和技术应用方面做出成果。

Q5

您未来的研究方向是什么？

我在GPCR方向的课题有了不错的积累，想继续进行更加深入的研究。GPCR家族有800多个成员，对人体生理代谢的几乎所有方面都有重要影响，目前市场上超过30%的药物都是以这一类蛋白为靶点的。但是，目前人类仅解析了不到70个GPCR的结构，还有许多具有重要生理学功能的GPCR有待我们去研究。

冷冻电镜目前已经是结构生物学研究的主流方式，为我们了解GPCR的结构和功能提供重要支持。一方面，我们要研究GPCR与不同类型配体相互作用的复合物的结构，解析受体在不同功能状态下的构象变化。另一方面，特定类型的GPCR如何与激发不同的信号传导还需要更多结构生物学信息提供支持。香港中文大学（深圳）科比尔卡创新药物开发研究院主要从事创新药物开发，冷冻电子显微镜给药物开发提供了非常好的手段，通过冷冻电镜研究蛋白的药物靶点的结构，为药物开发和优化提供更多的依据。

此外，在冷冻电镜技术方面也可以继续进行研究。冷冻电子显微镜的应用越来越广泛，但是它还是有一定的技术门槛的，在样品制备、数据采集和数据处理环节中，操作人员都需要受过一定时间的专业培训，结构解析过程也需要科研人员在三维重构、编程和生物学方向的专业知识。将来我们可以优化现有的操作流程和方法，使得这项技术发展的更加成熟，降低技术门槛，让越来越多的科研人员能够娴熟地应用冷冻电镜技术。

Q6

在选择专业和从事科研方面，请给我们同学一些建议。

在专业选择方面，除了兴趣以外，也要充分了解专业的发展趋势，要看学科和专业的未来会有怎样的发展。多和业内人士沟通，来判断是否真的是自己想要做的方向。在信息化的社会，许多工作都需要各个行业的人才紧密合作才能完成，无论选择什么方向都要重视和加强人际间的合作与交流的能力。

在对待科研的态度方面，我认为兴趣最重要。做科研的人每天接触到的都是最前沿的知识，每当有新的成果做出来或者发现新的现象，激动的心情是无法用言语表达的。然而在实际工作中，大部分时间要应对许多枯燥、辛苦的工作，经常需要阅读大量的文献才能找到某个问题的答案，没有兴趣很难坚持下来。另外，科研工作的研究结果往往是未知的，并非所有结果都能达到预期，或者在实验过程中经常遇到瓶颈，需要有很大的毅力才能坚持下来。

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转载自香港中文大学（深圳）生命健康学院微信公众号

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