干细胞行业的葵花宝典：MSC的分离方法总汇
分离MSC，是研究和应用MSC的第一步。
由于体内MSC的异质性（通常由粘附细胞的异质亚群组成），导致分离方法众多。1970年Friedenstein教授利用形成克隆（CFU-F）的特性来分离和鉴定MSC(1)。所得的粘附MSC细胞的起始群体也是异质的，并且含有低比例的多能干细胞(2)。有观点认为MSC在体外存活和分化的能力并不能代表其治疗效力(3)。通过分离工艺纯化MSC的某个亚群，可以显著提高当前常规MSC的临床治疗的效果(4)。有学者建议寻找新的标记物和方法来分离和检测不同组织的MSC，从而有利于建立可靠且可重复的MSC临床级别的大规模培养，而不受造血细胞的污染(5-7)。自动生物反应器扩增的MSC具有和全人工手动培养的MSC一样的功能特性，但是能显著提高工业化产出的效率和降低人工成本(8)。
因此，本文简要介绍目前主要MSCs分离技术，其基本原理，以及它们的优点和局限性(9)。
总的原则：
可以通过多种方法来分离不同组织的MSC，比如物理特性、化学结合、粘附性、细胞表面分子的特征（表明抗原）、细胞的大小和密度等。
基于细胞物理参数（大小和密度）的主要分离技术有密度梯度离心、淘洗或膜过滤。基于细胞粘附于组织培养塑料的不同能力而广泛使用的分离技术是塑料粘附方法。这些方法主要用于初步分离MSC，因为它们具有较低的分辨能力。另一方面，它们是快速、简单和有效的。此外，贴壁分离方法获得的MSC细胞保持“未被触及（untouched）”，并且不形成细胞-抗体复合物。“细胞-抗体复合物”的操作被认为不仅仅是一种“最小细胞操作技术”而受到当地监管机构的较高的监管要求(10)。
免疫亲和分离技术具有高分辨率和特异性的特点，其基于细胞表面上特定分子的表达，通过荧光分子或磁性颗粒结合特异性细胞表面抗原。但是该分离领域的挑战是缺乏一种定义MSC的通用标记，不同的研究采用了不同的细胞表面抗原分子。
下图中描述了不同的5种主流MSC分离技术和基本原理及其优点/缺点。
密度梯度离心方法
这类分离方法的原理在于细胞通常具有不同的物理和化学参数，如大小和密度，或静电和疏水性质。典型的例子是不连续的密度梯度离心，这是一种广泛使用的低分辨率细胞分离技术，常用分离液有Percoll™，Ficoll- Paque™，Lymphoprep™或Histopaque®）。细胞沿密度梯度移动并停置在其密度与分离液密度匹配的位置。或者使用不同密度的两种不混溶溶液，所需的细胞添加在最上层液面，离心后细胞将在沉降在两种分离液之间。通常，骨髓（BM）或脐血（UCB）在密度梯度介质（例如Ficoll-Paque）上分层，并且在离心过程中红细胞和粒细胞沉积在管底部，而较低密度和较慢沉积的单个核细胞（包括MSC）停留在中间形成白膜层(11)。吸取这白膜层的单个核细胞还可以进一步通过贴附方法或荧光激活细胞分选（FACS）或磁激活细胞分选（MACS）来富集MSC(12, 13)。
额外注意：分离脂肪组织的MSC（即ADSC），可以不需要密度梯度离心，直接用胶原酶消化后离心即可获得脂肪MSC(14)。
此外，有一种可离心分离方法是逆流离心淘洗（counterflow centrifugal elutriation，CCE），通过泵连续输送液体进入离心室，离心室持续离心。CCE的原理是较大的细胞倾向于留在离心室内的流动液体中，而较小的细胞被冲走并且可以收集在系统的出口处。
CCE用于从人骨髓（BM）中分离MSC(15)或脐带（UC）MSC(16)。该方法的优点是不需要特殊的密度梯度介质，在分离后细胞保持最小的影响；然而CCE仅限于分离能够单独悬浮在缓冲液中的细胞，适合应用于其他离心的方法不能分离不同类型的具有相似的沉降特性的细胞。
商业上可用的全自动系统，基本上都是基于离心的细胞分离，如Sepax®system（Biosafe）、Harvest BMAC System（Harvest）技术）或BMC设备（DSM Biomedical）。其中BMC装置能够在90秒内集中骨髓单个核细胞（MNC），与基于Ficoll的梯度分离方法相比，MNC产量提高10倍(17)。另外，符合GMP和GLP法规的Sepax®系统可用于从骨髓中回收MSCs(18)、新鲜脐带血(19)或用于分离ADSCs(20)。
贴壁培养分离法
通过贴壁培养来分离和培养，也是常用的方法。和MSC混在一起的造血系统的细胞不具有贴壁的功能，并且在培养基更换期间被冲洗掉(21)。与密度梯度分离方法相比，整个骨髓细胞种植在培养瓶中培养，粘附细胞的数量增加，同时减少MSC的损失(22)。
然而，通过培养瓶粘附培养MSC的缺点之一是未知的MSC的细胞亚群很多，异质性明显，这些MSC细胞亚群在其增殖和分化潜能方面有一些差异性，甚至包含一些内皮细胞和内皮祖细胞。尽管在传代期间可以去除许多非MSC细胞，但是这些其他种类的细胞会影响MSC的扩增以及临床治疗的总体效果。通过贴壁分离培养的MSC，其较高的传代数显示粘附分子的表达减少，趋化因子受体的丧失和对趋化因子的反应减弱(6)。
膜过滤分离法
MSC的分离还可以通过各种膜过滤方法进行。分离原理本身并不仅仅取决于筛分效果，而且取决于MSCs与膜的粘附强度。此方法简单，无菌，成本低，处理时间短。例如，可以使用PU泡沫膜在30分钟内从脂肪基质血管组份（SVF）溶液中分离脂肪MSC（ADSC），而常规的粘附培养方法通常需要1-2周(23)。
最近，将膜过滤法与粘附培养法结合，将其一起称为膜迁移法。将细胞悬液种植在膜上，继续在聚苯乙烯皿上培养约2周， ADSC就会从膜中迁移出来；与仅通过膜过滤获得的MSC相比，迁移的细胞显示出最高的MSC表面标志物表达和更有效地向成骨细胞分化(24)。
免疫亲和分离法
这种分离方法的应用集中在流式细胞仪分选技术和磁珠分选技术。
基于免疫亲和性的细胞分选方法，具体特异性和精准性，能最大限度地减少分离细胞的异质性。然而，对于这些分离方法的最大挑战是缺乏用于定义MSC的特异性表面标记物；而且分离到的MSC群体依然显示出种群内异质性和供体的变异性，即不同供体来源的MSC的某些标记物的表达有差异性(25)。
由于流式细胞仪技术（FACS）（上图a）具有独特的分辨能力，能实现所需细胞群的极高纯度（95％-100％）。如果进行无菌分选，也可以进一步培养细胞。另一方面，尽管FACS具有高分辨率容量，但它具有一些局限性，其中一个主要缺点是需要昂贵的设备和熟练的技术人员来操作它。由于对分离细胞的高剪切应力，在分选期间细胞活力也会受到损害。此外，由于产生的气溶胶，FACS带来了明显的污染风险；FACS分离的效率比较低，这导致相当长的处理操作时间。由于上述限制，目前FACS主要适用于生物医学研究的细胞纯化，但对于临床应用的细胞处理非常有限。
另一方面，FACS已经被广泛用于基于CD34阳性的人造血干细胞（HSC）的纯化(26)。Influx™细胞分选平台（BD Biosciences）可以使用一次性流体包，从而消除交叉污染的风险并支持无菌分选。仪器也可以放在安全柜中，以确保生物安全。然而，昂贵的一次性使用套件限制了推广应用。目前，创新的一次性微芯片封闭式微流体系统即将在临床研究中用于研究。比如，MACSQuant®Tyto™流动分选平台（Miltenyi Biotec）使用微芯片技术，通过微观极快阀门对细胞进行分选，细胞通过非常低的压力驱动（约3 psi），因此分离出来的细胞活力和产量较高。这也可能在治疗应用领域彻底改变MSC的FACS分选。当然，最终决定因素将是完整分离过程的总体成本效益。
磁珠分选（MACS）技术（上图b）是一种强大且易于使用的工具，用于将确定的细胞群和亚群分离至高纯度。目前有各种磁性细胞分离系统。它们的主要区别在于两个特征：用于细胞标记的磁性颗粒的组成和大小以及磁分离模式(27)。将标记和未标记细胞的混合物置于磁性分离器的高强度磁场中，其中标记的细胞保留在磁场中并且可以作为标记收集；未标记的细胞则流过磁场，也可以作为未标记的部分收集。
MACS的阳性选择方法通常更有效和更快，允许以高回收率和纯度分离特定细胞群体。阴性选择通常用于在培养物扩增之前富集MSC。最常见的是基于CD45 / GlyA的阴性选择。但是也有研究表明，与阳性选择策略相比，这种阴性选择方法可能无效(28)，并且还观察到成纤维细胞，成脂细胞和成骨前体细胞的低效率扩增(29)。然而，这两种分离模式可以组合在一起，为顺序分选复杂的细胞亚群提供更大的灵活性。
与FACS技术相比，MACS可提供更快的分离速率（高达1011个细胞/小时），分离细胞的高活力率（因为施加到细胞的剪切应力较低），并且可以并行处理样品而无需昂贵的设备(30)。如果组合两个随后的磁分离循环，获得的细胞群的纯度与FACS几乎相当（超过95％）。然而，使用自动细胞分离器CliniMACS®Plus和CliniMACS®Prodigy系统（Miltenyi Biotec），可以在封闭和符合GMP标准的无菌环境中磁性富集靶细胞或去除不需要的细胞。例如CliniMACS CD34 抗体系统（富集CD34 +细胞）在自体和异体造血干细胞（HSC）移植中使用了20年；而且，它是世界上唯一经FDA批准的用于急性髓性白血病（AML）患者以减少GVHD的装置(12)。目前，该仪器还允许临床大规模富集CD271+ MSC用于组织再生的治疗。
细胞表明标记物分离法
尽管到目前为止，已经发现和鉴定了许多MSC表面标志物，但我们仍然缺少特异性表面标志物以鉴定MSC，正如HSC之CD34标志物。另外，从各种组织获得的MSC之间的标志物表达存在很大差异，并且随着它们在培养中会出现标记出现物的变化(25)。目前，较多使用的表面标记物有：CD271、Stro-1、CD146、MSCA-1、CD105、GD-2、SSEA-4等。
其他的分离方法
一种基于亲和力选择性地捕获单个核细胞中的MSC过滤器。比如一种新型骨髓MSC分离过滤装置(31)，其在非织造人造丝/聚乙烯织物过滤器（nonwovenrayon/polyethylene fabric filter）内收集有核细胞而无需在封闭系统中离心；然后将分离的骨髓有核细胞直接贴壁培养，所获得的贴壁细胞符合MSC的标准。这种装置相对是一种更安全，更省力，更省时的分离MSCs的方法，具有进一步临床应用的潜力。CD106+/STRO-1+细胞对这种类似装置中使用的过滤材料具有高亲和力，捕获的细胞直接应用于体内骨组织的再生(32)。
此外，使用SELEX（Systemic Evolution of Ligands by EXponentialenrichment）技术，利用高特异性DNA适体（没有天然存在的DNA寡核苷酸的短片段）来选择性捕获靶干细胞，不需要特定的表面标记来分离细胞，并且该方法可以用作粘附方法或基于抗体的亲和方法的替代方法(33)。SELEX技术还可以与微流体系统结合，选择合适的适配体，以实现更快速有效的筛选过程(34)。
小小结：
MSC的分离，是MSC体外扩增和应用的非常重要的第一步。纯化或富集功能亚群可以显著地提高MSC临床应用的治疗效率。目前在开发创新的符合GMP标准的封闭系统方面取得了相当大的进展，允许在完全无菌的环境中分离和扩增某一亚群MSC，并且更容易得到各国监管机构的批准。
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