*题目中的干细胞专指间充质干细胞*
健康状态下，人体免疫系统处于一种稳态，既能识别和杀伤外来细胞或者变异的细胞，又能制约这种杀伤力，避免杀伤太过而殃及健康的组织细胞。人体中又广泛存在具有免疫调节功能的间充质干细胞（MSC），那么免疫系统和MSC必然存在纠缠不清的或者互利互惠的相互作用方式。
大部分的关注度在于MSC对免疫系统的影响，较少的研究侧重于免疫系统对MSC的作用。不少的研究者都已经明确了MSC不同于传统的化学药物和生物制剂，但是受到其他种类的干细胞的深刻影响，至今为止依然认为MSC是通过分化为身体组织的不同类型的细胞来发挥治疗作用。
因此，本文从免疫细胞对MSC的作用这个角度出发，阐述MSC进入体内的归宿，解释了为何MSC并不是通过分化来发挥治疗作用，即使MSC具有体内分化的能力。
首先，MSC具有体内分化的能力。妊娠早期，羊胎儿的免疫系统尚未得到建立，将人骨髓MSC注射到胎羊体内，可以观察到人MSC在多个组织中存活长达13个月，而且观察到MSC能分化为软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和心肌细胞、骨髓基质细胞和胸腺基质细胞[1]。更多类似的研究内容，请看本公众号另一篇文章《为何还有人否定间充质干细胞是干细胞？》。但是13个月后就检测不到人MSC的存在，说明人MSC进入羊体内，依然被羊的免疫细胞所清除[1]。
其次，需要大家认识到的是，由于MSC具有一定的免疫原性，所以不管是静脉注射还是局部注射的MSC，都避免不了迟早被机体免疫细胞清除的命运，所以需要多次反复注射才能获得较好的疗效。当然，反复注射MSC也会引发另外一个问题，从而会影响到疗效，本文也随后给与讲解。
在多种动物物种中已经观察到异基因MSC没法长期定植，包括鼠[2, 3]，狒狒[4]，猪[5]和恒河猴[6]。不同动物模型都观察到了4周或更长时间的异体MSC的存活[2, 4, 7]。然而，其他研究表明，与自体MSC相比，异体MSC输入人体后的存活率降低了[8, 9]。尽管MSC的存活时间相对较长（长达24天），但在大鼠接受异体MSC颅内注射的部位，中性粒细胞、单核细胞和T细胞数量增加[2, 9]。
在大鼠异位骨形成模型中，种植在陶瓷支架上的异体MSC在皮下植入后迅速被破坏，并在这些植入物中可以发现淋巴细胞浸润，这表明了宿主的免疫反应[10]。有趣的是，联合使用短疗程的他克莫司，MSC可以在支架中形成成骨分化细胞[10]。也有相反的研究结果，与对照组相比，异体MSC处理的皮肤伤口内中性粒细胞、单核细胞和T细胞数量减少，这提示异体MSC的抗炎作用优于局部注射细胞触发的局部免疫反应[7]。2012年卡罗琳斯卡大学医院的团队对接受MHC不匹配或单倍体相合MSC的18例患者的组织进行了尸检组织分析，没有观察到异位组织形成（即没有分化）；只有一名患者（严重的免疫功能减退）在去世前7天接受了MSC输注后在多个组织中显示高水平的供体DNA（>1/1000个细胞）[11]。2020年美国Wisconsin–Madison大学医学院的一个团队开展肠炎小鼠模型的治疗研究发现，不仅热灭活的MSC失去了所有的治疗作用，而且刚解冻的MSC治疗效果也有较大程度的下降（与PBS对照组没有差异）[12]。
但是，这个研究的数据提示静脉注射MSC却不能有效治疗肠炎，有效的治疗方式是腹腔注射和皮下注射MSC[12]。腹腔注射的MSC可以快速迁移到肠炎部位，但是皮下注射却优于静脉注射，这个就比较费解了。因为皮下注射需要经过血液循环才能快速迁移到肠炎部位，也就是说皮下注射的MSC不仅需要面临皮下组织的巨噬细胞的吞噬，还要面临血液里面的免疫细胞对MSC的清除。这个结果和之前的很多研究结果相反，有效性研究是容易重复出来的，相反的结果只能说明其中一方的数据有问题。
单核吞噬系统（MPS）细胞是先天免疫系统的基本细胞，对生理变化和外界环境变化做出反应，从周围通过吞噬获取信息，并将抗原信息传递给适应性免疫系统（抗原提呈），以便协调解决病理问题。在这些动态平衡适应过程中，不同表型的巨噬细胞也可以从血液、脾脏和骨髓[13]的单核细胞库中招募，也可能从常驻组织祖细胞或通过局部增殖[14, 15]。组织驻留的巨噬细胞具有动态的表型和功能，会自我更新，并在稳定状态下持续数月甚至数年。当被炎症或其他病理刺激激活时，幼稚巨噬细胞根据周围的微环境分化为激活的巨噬细胞，分别为M1（促炎）或M2（抗炎）表型。虽然这种巨噬细胞的命名仍然在使用，但2016年哈佛医学院的教授认为巨噬细胞具有更多的功能，可以考虑根据巨噬细胞在组织器官的活动来命名它们[16]。
但是，在许多情况下，这些动态平衡和修复功能可能会被持续的损伤（病因）所破坏，导致巨噬细胞与纤维化、肥胖症和癌症等疾病状态的因果联系[17]。
10年多年前就认识到，巨噬细胞和MSC共培养后，产生更多的IL-10和IL-6，而巨噬细胞减少分泌IL-12和TNF-α等炎症因子[18, 19]。MSC增强巨噬细胞的吞噬活性，这部分依赖于对含有MSC线粒体的胞外小泡的摄取，而且MSC诱导的巨噬细胞以吞噬依赖的方式增加amphiregulin的分泌，从而维持了损伤后的组织稳态和修复[20]。
但是MSC静脉输注后，滞留于肺部的MSC能吸引大量巨噬细胞和中性粒细胞重新聚集到肺部[21]，单核细胞和中性粒细胞通过吞噬MSC从肺中清除MSC，随后这些细胞通过血流迁移到身体的其他部位，特别是肝脏，进而调节适应性免疫系统的细胞[22, 23]。在大鼠和小鼠体内均发现人MSC促进巨噬细胞和中性粒细胞浸润到注射部位[24, 25]。吞噬MSC的肺巨噬细胞获得通过抑制性M2表型，降低了体内气道反应性，减少了卡巴胆碱诱导的离体支气管收缩，从而减轻了哮喘[23]。2020年《nature》杂志的一篇文章发现，心内注射骨髓单个核细胞和心肌干细胞（就是大名鼎鼎的哈佛大学Piero Anversa教授长期造假的c-kit+细胞），都能诱导CCR2+和CX3CR1+巨噬细胞的局部聚集；这种巨噬细胞反应改变了心脏成纤维细胞的活性，减少了交界区细胞外基质的含量，提高了损伤区域的力学性能[26]。因此，作者认为心脏MSC疗法的功能益处归功于一种急性炎症性伤口愈合反应，使心脏梗死区恢复活力。
在特定的疾病模型中，MSC的免疫调节作用并不依赖于它们与免疫细胞的分泌或主动串扰，而是依赖于单核细胞对MSC的识别[27]。而且，从MSC产生的膜颗粒能够通过靶向炎性CD14+CD16+单核细胞，进而诱导促炎单核细胞凋亡来调节免疫反应[28]。NK细胞是一种大颗粒淋巴细胞，一旦被激活，既能直接裂解靶细胞（类似于CD8+T细胞），又能释放促炎介质（例如IFN-γ和TNF-α）。NK细胞的杀伤功能受到一系列复杂表面受体发出的激活信号和抑制信号之间的平衡的严格控制[29]。在异体MSC的情况下，考虑到静息状态下MSC表面MHC蛋白的低表达水平，NK细胞介导的体内溶解的可能性是一个重要的考虑因素。虽然MSC可以通过前列腺素E2和吲哚胺-2，3-双加氧酶的作用抑制细胞因子诱导的NK细胞增殖和激活标记NKG2D的表面表达[30]，但是激活的NK细胞能够有效地裂解人类自体和异体MSC细胞[30-34]。NK细胞还可以诱导MSC的凋亡，而MSC的凋亡小体介导了Th2的免疫反应，从而发挥了MSC的免疫抑制功能[35]。脑内注射异体MSC在10天后，恒河猴的循环T细胞和NK细胞显著增加，而注射自体MSC的猕猴则未见明显增加[36]。对NK细胞而言，自身MHCⅠ类分子作为一类抑制性受体的配体。MSC表达MHC I类分子，可以在一定程度上抑制了NK细胞对MSC的杀伤。
但是MHC I类分子确实可以被CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）所识别，从而导致表达MHC I类分子的MSC被CTL细胞所杀伤。MHC II类分子则可以被CD4+T淋巴细胞所识别，CD4+T细胞被激活后，可以直接杀伤携带MHC II类分子的细胞，也可以将信息传递给巨噬细胞和B细胞。
虽然MSC一直被认为是相对免疫豁免的特权，但是即使是自体MSC，依然具有一定的免疫原性（很弱）。在某些条件下，已经观察到MSC可以上调MHC I类和II类的表达[37, 38]。少数报告提供证据表明，人和小鼠的骨髓MSC都有提呈抗原的能力，随后在体外诱导效应性T细胞反应[39-41]。新西兰白兔骨髓MSC经过IFN-γ（100 IU/ml）培养3天后，骨髓MSC的MHC II类抗原分子表达增加；但是在混合淋巴细胞反应（MLC）实验中，经过IFN-γ培养的MSC的免疫抑制能力得到增强[42]。IFN-γ可显著诱导MHC-I的表达，而对MHC-II的诱导作用较弱而且出现延迟现象，这是由于MHC-II抗原在细胞内转运到膜表面的速度较慢[37]。也需要注意的是，在长时间的干扰素-γ培养MSC后，MSC的增殖出现减弱，甚至减少了50%，但没有细胞死亡的迹象[37]。尽管在干细胞标志物的表达和分化的能力方面是同质性的，马骨髓MSC在MHCⅡ类分子的表达上差异很大[38]。有意思的是，有研究发现MSC的MHC II类分子的高表达与MSC的疗效没有必然的联系。给大鼠心肌缺血部位局部注射大鼠骨髓MSC后，虽然MSC明显提高了疾病模型大鼠心功能，同时组织病理切片检测结果发现注射的MSC的MHC I和II类抗原分子的表达都增加[43]。同样的现象也出现在小鼠肠炎模型，即IFN-γ在促进MSC高表达MHC II类抗原分子的同时，提高了MSC的免疫抑制能力和治疗肠炎以及GVHD的效果[44, 45]。用IFN-γ刺激MSC可上调MHC I和II类，这可能会使这些细胞在具有免疫能力的宿主中容易发生排斥反应[46-48]。相反，大剂量IFN-γ可以增强MSC对T细胞、单核/巨噬细胞和DC的抑制作用，提高细胞治疗的效果[45, 49, 50]。这些观察结果与IFN-γ介导MSC的IL-10、TGF-β1、PGE2、IDO的上调有关。虽然在某些意义上是自相矛盾的，一方面，这些相互作用可能导致进一步诱导MSC有益的、免疫抑制的特征，另一方面，它们可能使MSC更容易被细胞毒性T细胞和NK细胞所清除。更好地认识到这两个过程并不是相互排斥的，未来应该仔细地并行研究，这将是MSC应用于炎症和免疫介导疾病治疗的关键一步。有意思的是，最近研究发现IFN-γ和缺氧并没有显著改变骨髓MSC分泌的外泌体中的miRNA含量，具有很高的个体间变异性[51]。多年前就有专家提出MSC并不具有免疫豁免特性，而只是其免疫原性比其他类型的同种异体细胞低很多[52]。在多个动物模型的研究已经证实，MHC不匹配的MSC诱导产生MHC特异性记忆T淋巴细胞，即同种异体MSC可以诱导了一种免疫记忆，可以导致随后注射的同一来源的MSC的存活率显著降低[3, 5, 6, 8, 9, 53-55]。有趣的是，在体内没有观察到干扰素-γ刺激的异基因MSC的免疫原性增强现象[3]。单次注射MHC不匹配的脐带MSC并不能诱导产生免疫反应，但是当在炎症部位注射、在同一区域重复注射或注射前用IFN-γ刺激时，MSC具有明显的免疫原性[47]。美国德克萨斯A&M大学的大型动物临床科学系有一团队发表马的研究，提示2次异体MSC关节腔注射（相隔4周），能加重膝骨关节炎的疼痛[56]。这篇文章的结果和很多的动物和临床研究结果相反，加上样本量太少（每组6例），所以可以认为结果不可靠；如果结果的数据可靠，那只能说MSC注射液出了质量问题。有证据表明，同种异体MSC可以被γδT细胞[57]和细胞毒性CD8+T细胞[34]所裂解。最近的研究发现46%的骨髓MSC被外周血单个核细胞（PBMC）所裂解，裂解率与PBMC/MSC的细胞比例成正比，而且不同个体的PBMC对MSC的杀伤活性明显不同[58]。但是，有一项研究提示，只有对MSC具有高细胞毒活性（杀伤MSC的能力）的患者才对MSC输注有反应，而那些低活性的患者则没有反应；因为输注后，吞噬细胞吞噬凋亡的MSC，并产生吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO），而IDO是最终产生免疫抑制所必需的[35]。2，MSC反复注射可以产生抗体，
加速MSC清除
在猕猴颅内植入异体骨髓MSC后，出现循环中的白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的短暂但显著的增加，并在猕猴体内检测到循环中的同种抗体，但发现受体血清与补体介导的溶解无关[6, 36]。不仅是猕猴，在注射MHC不匹配的MSC的小鼠、大鼠、猪和马中也检测到同种抗体[3, 5, 53, 59, 60]。未经处理和IFN-γ预处理的异体MSC，都能刺激健康大鼠注射异体MSC后产生供者特异性抗体[3]。静脉注射同种异体MSC可导致同种异体抗体的形成，这种抗体能够促进补体介导的针对MSC的溶解，伴随产生较低水平的IgM分泌[61]。接种了不匹配的异体MSC的小鼠在第二次输注的24小时内表现出对供者来源的脾细胞的快速排斥反应[54]。接受异体MSC腹腔注射的小鼠产生了高滴度的同种异体反应抗体，并排斥了随后的同种异体皮肤移植[53]。但是，需要明确的是，并不是所有的注射MSC的个体都能产生相对于的抗体。给马皮内注射MHC不匹配的MSC，约37%的马会产生细胞毒性的抗MHC I同种抗体[59, 60]。Mesoblast公司的骨髓MSC产品用于心衰竭的局部注射治疗，11%的患者体内检测到针对异体骨髓MSC的HLA-I类抗原的抗体，只有1名患者检测到骨髓MSC的HLA-II类抗原的抗体[62]。同样是心衰患者，10名患者中有4位接受异体脂肪局部注射治疗后，能检测到异体脂肪MSC的HLA-I类抗原的抗体[63]。最近两项人MSC临床试验监测患者同种异体抗体的产生，发现虽然大多数患者在注射同种异体骨髓MSC后没有产生显著的同种异体抗体，但少数患者确实产生了同种异体抗体[64, 65]。
有趣的是，在猪的心肌梗死模型中，MSC诱导的同种抗体的产生可以通过联合应用免疫抑制剂钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司来预防[61]。联合使用异体MSC输注和小剂量西罗莫司（雷帕霉素）治疗可以使MHC完全不相合的小鼠心脏移植获得长期存活[66]。将C57BL/6小鼠来源的表达EPO的MSC（EPO-MSC）接种于胶原支架内，皮下注射同遗传背景基因宿主（C57BL/6）或异基因宿主（BALB/c）宿主；作为MSC存活的指标，接受同基因EPO-MSC的小鼠的红细胞压积持续增加，而接受同种异基因EPO-MSC的小鼠的红细胞压积出现峰值，随后恢复到基线水平；而且植入15天后取出的胶原支架分析显示，CD8+T细胞和自然杀伤（NK）细胞仅在同种异体EPO-MSC移植物中有明显的浸润，并出现了针对EPO转基因MSC的抗体，加速了异基因EPO-MSC的清除（红细胞压积的峰值降低）[9]。在另一项单独的研究中，将异基因EPO-MSC注射到具有免疫活性的宿主中，导致了对EPO抗原的增敏和抗EPO免疫反应[67]。所以，不建议多次应用经过基因编辑的MSC，机体的免疫系统会识别到所编辑的基因，从而产生免疫应答反应，加速了MSC的清除。马骨髓或脂肪组织来源的MSC通过静脉、动脉、腱内或眼内途径注射，89%的马在注射MSC后抗牛血清白蛋白（BSA）抗体呈阳性，但是抗BSA抗体的量与抗MSC抗体的产生没有相关性[68]。此外，MSC的细胞表面可以结合补体[69]，尽管补体对MSC功能的影响目前仍有争议，补体介导的MSC的裂解很可能依赖于同种抗体[70]。目前有许多标准的免疫学检测方法和技术可用于检测MSC的免疫原性。应该确定MHC单倍型，以了解供者或刺激者MSC与接受者或应答者细胞是完全不匹配还是部分不匹配。MSC的免疫调节功能可以用传统的MLR来衡量，即反应和刺激脾细胞或PBL与MSC共培养，但同种异体MSC抑制T细胞增殖的能力与同种异体MSC的体内免疫原性无关。单抗原珠(SAB)分析、ELISPOTS和HLA四聚体也被用于筛选人类血清中MHC特异性同种抗体[71]，商业试剂盒也很容易买到。然而，这些检测并不能确定同种异体抗体的功能。
3，小结
综上所述，MSC不能被认为是真正的免疫豁免特权。MSC排斥的时间和严重程度依赖于MSC表达免疫原性和免疫系统之间的平衡决定。
尽管如此，但是使用同基因(或自体)和异基因MSC的临床前模型和临床试验并未显示出与异基因MSC相关的不良事件。来自检测同基因和异基因MSC在伤口修复小鼠模型的数据表明，同基因和异基因MSC不会像同种异体成纤维细胞那样引起免疫反应[7]。使用骨髓MSC治疗急性类固醇抗药性GVHD的2期临床试验的数据也表明，使用同种异体骨髓MSC不会触发免疫反应[72]。甚至凋亡的MSC亦能降低盲肠穿孔导致肺和肾损伤大鼠的死亡率、血液中的TNF-α水平以及循环和脾脏T辅助细胞和细胞毒性T细胞（CTL）水平均显著降低[73, 74]。自体MSC与异体MSC的疗效是否对等？这个问题牵涉到的影响因素太多了，包括供体的年龄和健康状态和MSC的培养体系等等。还需要注意一个关键的问题是，不同个体来源的MSC本身固有的免疫调节特性是否足以克服同种异体细胞所产生的免疫应答和免疫记忆过程。
传统观点认为，通过延长MSC注射后的持续期可以增强MSC治疗的益处。但是，延长MSC的存活或提高MSC的免疫耐受性可以提高MSC的治疗效果，这一点尚未在临床上得到证明。即，延长MSC在体内的存活时间将转化为持续的治疗效果和改善临床结果的假设，还有待临床实践的检验。
总体而言，目前认为MSC具有在体内启动细胞免疫和体液免疫反应的能力，但由于固有的抗炎和免疫调节特性，与其他同种异体细胞相比，免疫原性的影响可能会大大减弱，从而整体上显示出了良好的治疗效果。这一点，在大量的临床应用研究的文献中得到了很好的证明，展示出MSC良好的治疗效果。
正是由于MSC具有在体内启动细胞免疫和体液免疫反应的能力，那么在临床应用治疗方案的确定上，应该把MSC的这个免疫原性考虑进入，采取一定的措施来尽可能降低MSC的免疫原性对治疗效果的影响。
一句话总结MSC进入体内的命运：MSC在不断发挥治疗作用的同时，自己也被机体免疫细胞所识别和清除。
MSC正如蜡烛：燃烧自己，照亮别人！