实验时间 | 实时荧光定量 PCR（realtime PCR）

所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

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实验步骤

一、 样品 RNA 的抽提

1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其完全溶解。
   

2. 两相分离 每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30 ℃ 孵育 2 到 3 分钟。4 ℃ 下 12 000 rpm 离心 15 分钟。

   离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。

3. RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30℃ 孵育 10 分钟后，于 4℃ 下 12 000 rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4. RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃ 下 7 000 rpm 离心 5 分钟。

5. RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5～10 分钟。
   

6. 溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的 RNA 溶液保存于 -80 ℃ 待用。
   

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