实验时间 | 细胞冻存和复苏实验方法

细胞冻存和复苏可以：（1）用于生物学保种；（2）用于医学上干细胞研究；（3）用于传代培养。

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实验方法原理

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

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实验步骤

一：材料准备

1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、 培养瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、废液缸。

3. 塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（10 ml）、15 ml 离心管、冻存管（1～2 ml）。

4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。
   

5. 试剂：D-Hanks 液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4% NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

二：细胞冻存

1. 配制含 10% DMSO 或甘油、10～20% 小牛血清的冻存培养液。

2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至 15 ml 离心管中。

3. 离心 1 000 rpm，5 min。

4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为 5×10⁶/ml～1×10⁷/ml。

5. 将细胞分装入冻存管中，每管 1～1.5 ml。

6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率 -1～-2 ℃/ min；当温度达 -25 ℃ 以下时，可增至 -5 ℃～-10 ℃/min；到 -100 ℃ 时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入 -20 ℃ 冰箱 2 h ，然后放入 -70 ℃ 冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
   

三：细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 37 ℃ 温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从 37 ℃ 水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加 10 倍以上培养液，混匀。

3. 离心， 1 000 rpm，5 min。

4. 弃去上清液，加入含 10% 小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37 ℃ 培养箱静置培养。

5. 次日更换一次培养液，继续培养。
   

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注意事项

1. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液。

2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。

3. 冻存和复苏最好用新配制的培养液。
   

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1. 冻存和复苏的原则：慢冻快融

2. 慢冻程序

3. 低温保护剂的应用

4. 细胞冻存方法

5. 保存细胞的复苏方法
   

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