免疫组化常见问题都在这里了
对于刚入门的科研小白，免疫组化步骤较为繁琐，而且一步错，步步错，有时候明明觉得自己都按照老师们提供的条件做，可惜就是没有得到预期结果，现我将自己的些许体会分享如下。
关于免疫组化的定义，原理，分类，优势等不再一一介绍（丁香园等主流平台都有介绍），我只叙述我认为「比较小」的问题，但这些往往决定了成败，遗憾的是我检索了比较多的资料，都没有详细的提及这些问题。
取材与制片
① 一定要按照标本的标本留取要求留取，譬如某组织要求固定前要求用湿润的生理盐水纱布，用干纱布则会大大影响实验效果，导致输在起跑线上。
② 制片厚度与均一程度很重要，若每张片子的厚度不同，则实验时所需条件的就会有差异，然我们不可能随意调整实验的反应时间，一般我们读研读博的医院都是研究型大学的附属医院，建议交由大病理科完成制片，由于某些科室有亚专科，由于成立时间相对较短，制片水平不如大病理科。
反应温度
本人建议常规 4 ℃，背景浅，反应温和，但长须过夜。也有些试剂推荐 37 ℃，反应较快，最不提倡的是室温，因为波动较大，如果非得用室温，譬如 25 ℃，建议使用水浴恒温箱。
如何取抗体
以抗体 1:1 000 稀释为例，枪头吸取 0.5 ul，首先这个很难观察到底取了多少，误差太大，假设不小心枪头外周沾了一抗很难察觉，所以建议梯度稀释法较妥，建议在不影响实验可换别的试剂，譬如 1:50 稀释，在误差不可避免的情况下降低影响。
如何滴加相应试剂
最简单粗暴的方式是将所有玻片同时浸入泡缸内，但是由于试剂昂贵，此法基本不可行。
很多采用移液枪滴加（每次约 50～100 ul 就能解决问题），但这就带来了新的问题，假设有 10 张玻片，每滴加一张所需时间为 20～30 s，从第一张到最后一张相差将近 5 min，如果最后一张滴加完在开始计时，假设反应时间为 5 min，那么第一张片子实际反应时间为 10 min，而只有第 10 张玻片反应时间为 5 min。
此问题在单人操作中尤其明显，需要操作者把握时间。当然假设你的反应时间为 12 h，那么 5 min 我认为就可以忽略。
平整放置玻片
玻片反应是一定要平整放置，不然液体流动导致反应时部分组织干片，无法着色或染色时出现非特异性着色。
染色时间
建议镜控，一张成功的免疫组化片子一定是轻松染色的，不用通过增加染色的时间来「提高」成功率，相反，一味延长染色时间容易导致非特异性着色。
如何插拭玻片
在经过 PBS 浸泡后，不要企图将组织上的液体彻底插拭干净，因为这样更容易干片，尽量甩干，但组织周围的液体一定插拭干净，这样滴加上去的液体由于表面张力不易流动。
所有操作中均要遵循的原则：不能干片
（除非实验步骤中有要求干片）
所有试验步骤操作方法均不难，难的是出现了问题如何取解决，由于整个流程中关键的步骤就那么 3～4 步，但是一旦出现问题，由于排列组合的原因，会出现多种组合，变得异常繁琐。所以一定要多思考。
另附出上述常见小问题导致失败的图片，供大家参考
脱片（右上角），酶消化程度尚且不够
注：如何防止脱片，已经在另一篇文中详细说明
染色时间过长导致非特异性着色
干片导致非特异性着色
过度消化-可见管腔内「光秃秃」，可以被红色附着的寥寥无几
同样的片子，同样的方法，注意了这些「小问题」后，实验结果确实是另一番结果：
成功的-100X
成功的-400X
PS：大家也许发现这几张的图片背景蓝色程度差别巨大，这是由于我在摸索条件的不同时期对于背景染色时间的摸索，大家不用在意这个问题，阳性表达是红色的，可以看到最后两张图阳性表达明显，定为准确，背景无着色。哈哈，当然也是我的得意之作。
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作者：倒卖原子弹
图片来源：倒卖原子弹
题图来源：视觉中国