实验时间 | 还在为凝胶迁移实验（EMSA）发愁？老司机为你指路 | 自由微信

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实验时间 | 还在为凝胶迁移实验（EMSA）发愁？老司机为你指路

2017-07-19 霸霸生物学霸

实验步骤

探针的标记

如下设置探针标记的反应体系：体系为 10 微升

待标记探针（1.75 pmol/微升）：2 微升。

T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10×）：1 微升。

Nuclease-Free Water ：5 微升。

[γ-³²P]ATP（3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml）：1 微升。

T4 Polynucleotide Kinase （5-10 u/微升）：1 微升。

依次加入各种试剂，加入同位素后混匀，再加入 T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
使用水浴或 PCR 仪，37 ℃ 反应 10 分钟。
加入 1 微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
再加入 89 微升 TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在 30% 以上，即总放射性的 30% 以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过 3 天。

探针的纯化

EMSA 胶的配制

准备好倒胶的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，便于干胶等后续操作。
配制 20 毫升 4％的聚丙烯酰胺凝胶。
加入 TEMED 前先混匀，加入 TEMED 后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。

EMSA 结合反应

如下设置 EMSA 结合反应

（1）阴性对照反应：体系为 10 微升；Nuclease-Free Water ：7 微升；EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液（5×）：2 微升；细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0 微升；标记好的探针：1 微升。

（2）样品反应

（3）探针冷竞争反应

（4）突变探针的冷竞争反应

（5）Super-shift 反应
加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20～25 ℃）放置 10 分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温放置 20 分钟。
加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液（无色，10×），混匀后立即上样。

电泳分析

用 0.5×TBE 作为电泳液。按照 10 V/厘米的电压预电泳 10 分钟。预电泳的时若有空余上样孔 49 30515 49 14987 0 0 882 0 0:00:34 0:00:16 0:00:18 2837可加入少量稀释好的 1× 的上样缓冲液，以观察电压是否正常。
把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。
按照 10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过 30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至 EMSA/Gel-Shift 上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘 1/4 处，停止电泳。
剪一片大小和 EMSA 胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有 EMSA 胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。把滤纸从 EMSA 胶的一侧逐渐覆盖住整个 EMSA 胶，滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后揭起滤纸。把滤纸侧向下放平，在 EMSA 胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
干燥 EMSA 胶。然后用 X 光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。