实验时间 | 免疫荧光技术，你还有多少不知道

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。实验主要分为直接法和间接法。

01

实验原理

荧光素标记的抗体与标本中的抗原特异性结合后，形成抗原抗体复合物并带有荧光素；再用荧光显微镜检查上述标本，荧光素受光照射激发就会发出荧光，在显微镜下可以清晰地看见荧光所在的细胞，从而能检测某种抗原的存在与否，并可结合定量技术计算含量。

02

直接免疫荧光技术实验操作

一、材料准备

1. 试剂：磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01 mol/L，pH 7.4、荧光标记的抗体溶液：以 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 进行稀释、缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH 9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。

2. 仪器与耗材：搪瓷桶三只（内有 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 1 500 ml）、有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）、荧光显微镜、玻片架、滤纸、37 ℃ 温箱等。

二、实验步骤

1. 滴加 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 于待检标本片上，10 min 后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30 min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01 mol/L，pH 7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3~5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用「+」表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达「++」以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

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