实验时间 | 大肠杆菌感受态细胞的制备

今天跟大家讲解下氯化钙法。

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原理

带有外源 DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒 DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源 DNA 的载体分子通过。

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实验步骤

1. 从 37 ℃ 培养 16～20 h 的平板中挑取一个单菌落（直径 2～3 mm），转到一个含有 100 ml LB 或 SOB 培养基的 1L 烧瓶中。于 37℃ 剧烈振摇培养 3 h。一般经验，1 OD600 约含有大肠杆菌 DH5α 10⁹ 个/mL。

2. 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0℃。

3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。

4. 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。

5. 每 50 ml 初始培养液用 30 ml 预冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2 溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2） 重悬每份细胞沉淀。

6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。

7. 倒出培养液，将管倒置 1  min 以使最后的痕量培养液流尽。

8. 每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重悬每份细胞沉淀。

9. 此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70 ℃。

更多问题

出现黑色沉淀是什么问题？

感受态制备过程中，如何将第一次离心后的菌体悬浮？

大肠杆菌感受态细胞制备时的 CaCl2 浓度到底是多少呢？

请戳阅读原文看回答。

作者：霸霸

题图来源：霸霸