实验时间｜质粒 DNA 提取实验
提取质粒的基本步骤分为三步：
①细菌的培养和质粒的扩增
②细菌菌体的裂解
③质粒 DNA 的纯化
今天主要跟大家讲解下碱解法。
材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。
2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。
3. 试剂：
① Solution I ：25 mM Tris-Hcl(pH7.4)，10 mM EDTA(pH8.0)，50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃ 保存。
② Solution II ：0.2 M NaOH， 1% SDS 现配现用。
③ Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃ 保存。
④ 3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃ 保存。
⑤ 异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70% 乙醇，LB 培养基，电泳试剂。
实验步骤
1. 细菌繁殖：LB 培养基，2 ml/20 ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜。
2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。
3. 沉淀（菌体细胞）预冷的 TES 缓冲液洗涤，离心 10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的 1 ml Solution I，冰浴 10 min。
4. 重新悬浮，加入 150 μL 溶菌酶母液，室温放置 5 min。
5. 加入 1.2 ml Solution II， 冰浴 5 min。
6. 加入 0.9 ml 预冷乙酸钾，混匀，离心 10min，12 000 rpm，4℃。
7. 加入 1.5 ml 异丙醇，-20℃ 冰箱内放置 15 min。
8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。
9. 取沉淀，悬于 400 μL TE 缓冲液中。
10. 加入 40 μL，3 M NaAc。
11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。
12. 离心 10 min，12 000 rpm，4℃。
13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于 50 μL TE 缓冲液中。
14. 电泳检测提取 DNA 的质量。
作者：霸霸
题图来源：霸霸