MLL1 小分子抑制剂研究进展（独家原创）

专家介绍 

    江程：副教授，硕士生导师。2007 年毕业于中国药科大学，同年留校任教。2013 年3 月至2014 年3 月在美国密歇根大学癌症研究中心任访问学者。主要研究方向：生物活性分子的设计与合成。主持国家自然科学基金项目2 项，江苏省自然科学基金1 项，参与“863”、“国家新药创制重大专项”等多项国家级和省部级项目的研究工作。2008 年获第十一届中国药学会-施维雅青年药物化学奖。2012 年获江苏省“青蓝工程”优秀青年骨干教师培养对象。目前已发表论文20 余篇。

正文

MLL1 小分子抑制剂研究进展

常玉杰1，姚爱红2，连国强2，丁振华2, 3，孙海鹰2, 3，王志祥1*， 江程2,3**

（1. 中国药科大学工学院，江苏 南京 210009；2. 中国药科大学药学院，江苏 南京 210009； 3. 江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，江苏 南京210009）

[ 摘要] 组蛋白H3K4 甲基转移酶MLL1 在基因调控、细胞增殖、生长分化等正常生理功能中发挥着重要作用。染色体带11q23 异位可导致MLL1 基因与其他基因融合而产生多种N 端与融合伙伴结合的MLL1 融合蛋白，与急性白血病的发生发展密切相关。MLL1 是目前肿瘤分子靶向治疗的热门靶标之一。综述了近年来MLL1 抑制剂的研究进展。

[ 关键词] 表观遗传调控；组蛋白甲基化；MLL1 抑制剂

表观生物学是研究具有遗传性的，能影响基因表达，却又不改变DNA 序列的因素的一门学科。其所研究的内容包括对构成染色体的组蛋白和DNA 的各种修饰，如DNA 的甲基化，组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，及这些修饰对DNA 表达的影响。组蛋白赖氨酸的甲基化及去甲基化是表观遗传学的重要研究内容，其调控机制失调与包括癌症在内的很多疾病都有密切关系，因此很多组蛋白赖氨酸的甲基化酶和去甲基化酶都已被认为是新型抗癌药物研究的重要靶点。混合细胞系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）蛋白是一类催化组蛋白H3 中的Lys4（H3K4）甲基化的甲基转移酶。目前在人体中已经发现了MLL1~ 5 等5 种亚型，其中被研究的最多的是MLL1。MLL 的功能并不仅限于催化H3K4 的甲基化，更重要的功能是促进Hox、Meis-1 等基因的表达。Hox 基因的正常表达对胚胎发育和血细胞分化有重要影响，但一些Hox 基因，如HoxA9 的持续表达则是带有MLL 重排基因的白血病的重要特征之一，而且在白血病的产生及发展中起着重要作用。染色体异位可导致MLL 基因与其他基因融合而产生多种MLL 融合蛋白，目前已发现了超过70种MLL 融合蛋白。这些融合蛋白主要是由MLL N 端的肽链与其他蛋白融合，因此这些融合蛋白不具备甲基转移酶的活性，但却具有融合伙伴的部分功能，其中很多都已被证实与急性淋巴性白血病（ALL）和急性骨髓性白血病（AML）有关，而且有些MLL 融合蛋白已被动物实验证明可直接诱发白血病。大约70% 的ALL和AML 幼儿患者及10% 的成人ALL 和AML 患者体内含有MLL 融合蛋白，其中最常见的是MLL-AF9 和MLL-ENL，这些病人的预后通常都非常不理想。由于MLL 及MLL 融合蛋白在MLL 白血病的发生发展过程中具有非常关键的作用，能够抑制其功能的小分子化合物有可能被研发成为新型的治疗白血病的药物。目前已有多种抑制MLL 及MLL 融合蛋白功能的小分子化合物被报道，根据其作用机制这些抑制MLL 功能的化合物可以分为3 类：第1 类是阻断MLL1 与WDR5 的相互作用，抑制MLL1 甲基转移酶活性的化合物；第2 类是阻断MLL 及MLL 融合蛋白与Menin 的相互作用的小分子化合物；第3 类是阻断MLL 融合蛋白与DOT1L 相互作用的多肽类抑制剂。本文中将对抑制MLL 及MLL 融合蛋白功能的小分子化合物的研究进展进行总结。

1 作用于MLL1-WDR5 的小分子抑制剂

作为一种甲基转移酶，MLL1 催化H3K4 甲基化的能力并不强，但它与WDR5、ASH2L 和RbBP5 形成的复合物则具有很强的催化H3K4 甲基化的能力，因此抑制MLL1 与WDR5 的相互作用是一种有效的抑制H3K4 甲基化的方法。WDR5 蛋白属于WD40 蛋白家族，由344 个氨基酸构成，含有7 个WD 重复序列。天然构象的WDR5 有7 个WD40 β 折叠，组成主要功能结构域。WDR5 介导甲基转移酶复合物与组蛋白H3 的链接，是组蛋白甲基转移酶复合物的核心组分之一，参与介导H3K4me3 基因转录激活过程。目前已报道的抑制MLL1 与WDR5相互作用的小分子化合物有2 类，一类是模拟WIN peptide 的多肽模拟物，另一类是基于高通量筛选和随后的结构优化发现的化合物。

1.1 模拟WIN peptide 的多肽模拟物

WIN peptide 是MLL1 中与WDR5 有较强结合能力的一个多肽序列。密歇根大学王少萌研究组通过系统地对WIN peptide 的C 端和N 端的氨基酸残基分别进行截断，发现乙酰化的三肽Ac-ARA-NH2 是能保持较强的与WDR5 的结合能力的最短多肽序列，其Kd 值为0.12 μmol · L-1 。通过对这个三肽的一系列结构优化，得到了MM-101（1），MM-101 抑制MLL1 与WDR5结合的IC50 值为2.9 nmol · L-1。在MM-101 中2 个苯环的对位引入氟原子，得到了MM-102（2）。MM-102抑制MLL1与WDR5 结合的IC50 值为2.4 nmol · L-1，其结合能力与MM-101 接近，但脂溶性有很大提高。在一系列的机制研究中发现MM-102 可以抑制HoxA9和Meis-1 的表达，并且诱导细胞的凋亡。随后的细胞增殖抑制实验表明，MM-102可以抑制MV4、MV11、KOPN8 这些白血病细胞系（ 其含有MLL1-AF4 和MLL1-ENL 融合蛋白）的生长，当其浓度为75 μmol · L-1时可完全抑制以上细胞的生长。在这些研究的基础上，王少萌研究组继续设计了一系列构象固定的环肽，其中MM-302（3） 和MM-303（4） 抑制MLL1 与WDR5结合的IC50 值分别为1.3 和1.2 nmol · L-1。与MM-101和MM-102 相比，这些化合物的细胞活性有显著提高。

1.2 非肽类小分子抑制剂

多伦多大学Vedadi 研究组通过高通量筛选发现了一类能够与WDR5 结合并阻断MLL1 与WDR5 相互作用的小分子化合物，如WDR5-0101（5，Kd=12 μmol ·L-1）、WDR5-0102（6，Kd=11 μmol · L-1） 和WDR5-0103（7，Kdis=13 μmol · L-1），并利用晶体结构证实这类化合物是与WDR5 中MLL1 的结合区域结合。他们对这类化合物进行了广泛的构效关系研究，合成了一系列衍生物，其中很多化合物与WDR5 有很强的蛋白结合能力。Grebien 等对其中一个化合物OICR-9429  的作用机制进行了研究，发现该化合物可以有效抑制WDR5 与WINpeptide 的结合，并且可以选择性地抑制表达p30 的人类AML 细胞的生长并诱导细胞分化。中国药科大学尤启冬教授研究组也对这类化合物的构效关系进行了研究，并发现了一系列与WDR5 有较强结合能力的化合物，其中具有代表性的化合物9 抑制MLL1 与WDR5结合的IC50 值为104 nmol · L-1 。

2 作用于MLL1-Menin 的小分子抑制剂

Menin 是将野生型MLL 和MLL 融合蛋白招募到靶基因的关键蛋白，并能作为癌基因辅助因子参与上调特定基因的转录，促进MLL 融合蛋白诱导的白血病的发生。阻断MLL和MLL融合蛋白与Menin 的相互作用，是另一种有效的抑制MLL 及MLL 融合蛋白功能的有效途径。

2.1 阻断MLL1 与Menin 相互作用的环肽

Huang 等研究发现，MLL1 与Menin 相互作用时是通过MLL1 中的一个八肽序列MLL1MBM （meninbindingmotif of MLL1， 氨基酸序列6 ~ 13 : Arg-Trp-Arg-Phe-Pro-Ala-Arg-Pro） 与Menin 中的一个疏水性区域结合。在此基础上，王少萌研究组首先确证了MLL1MBM 中与Menin 结合所需的最小的多肽序列是AcRWRFPARP-NH2，并根据这个多肽设计了一类环肽，其中与Menin 结合能力最强的MCP-1（10，Ki=4.7 nmol ·L-1） 。随后他们解析了MCP-1 与Menin 所形成的复合物的晶体结构，证明MCP-1 与MLL1MBM 都是与Menin 的同一疏水性区域结合。

2.2 噻吩并嘧啶类抑制剂

密歇根大学Grembecka 等通过对一个含49 000多个化合物的化合物库进行高通量筛选，发现了一个能够阻断MLL1-Menin 相互作用的小分子化合物MI-1（11），其抑制MLL1 与Menin 结合的IC50 值为1.9μmol · L-1。MI-1 属于噻吩并嘧啶结构化合物，将其结构中与噻吩环相并的环己烯环打开，分别替换为正丙基和异丙基，他们得到了MI-2（12）和MI-3（13），抑制MLL1 与Menin 结合的IC50 值分别为（446 ± 28）nmol ·L-1 和（648 ±25）nmol ·L-1。随后他们对MI-2结构中的正丙基取代基进行了优化， 发现将其用—CH2CF3 取代后，得到的化合物14（Kd = 22nmol · L-1）可以显著提高蛋白结合能力，原因可能是其中一个F 原子与Menin 中的His181产生了C —F...C =O 偶极相互作用。以化合物14 为基础，通过哌啶链引入含腈基的吲哚环，得到了MI-136（15），其Kd 值为23.6nmol · L-1。对MI-136吲哚环进行进一步的取代修饰，得到了MI-463（16，Kd = 9.9nmol · L-1）和MI-503（17，Kd = 9.3nmol · L-1）。进一步的研究表明，这2 个化合物在微摩尔每升的浓度水平就可以有效地抑制哺乳动物细胞Menin-MLL与AF9 相互作用；当浓度分别为0.23 和0.22μmol · L-1 时，可有效抑制MLL1-AF9转化的小鼠骨髓瘤细胞增殖；MI-463与MI-503可以有效抑制人类MLL 白血病细胞系（MI-503的GI50 为250 ~ 570nmol · L-1）。MI 系列化合物不仅可以有效抑制下游基因的表达，而且在多种白血病细胞中显示出很强的抑制细胞生长的能力。目前这一系列的化合物正处于临床前研究阶段。

2.3 其他作用于Menin-MLL1 的抑制剂

除了MI 系列化合物外，He 等还通过高通量筛选发现了MIV-1（18），其抑制MLL1 与Menin 结合的IC50 值为12.8μmol · L-1；他们对MIV-1 进行了详细的构效关系研究，合成了一系列化合物，从中得到了MIV-6（19），其Kd 值为85nmol · L-1，与MIV-1 相比，其对蛋白结合能力有了显著的提高。

另外，Li 等通过基于药效团的虚拟筛选，从大约900 种临床药物中筛选出了2 种氨基糖苷类抗生素—— 新霉素（20）和妥布霉素（21），发现它们可以抑制Menin-MLL相互作用，其Ki 值分别为18.8 和59.9μmol · L-1。

3 阻断MLL 融合蛋白与DOT1L 相互作用的肽类抑制剂

MLL 白血病主要是与MLL 融合蛋白相关，MLL融合蛋白没有SET 功能域，因此不具备甲基转移酶的功能，它们促进Hox 和Meis-1 等基因表达的共同机制之一是利用MLL 的融合伙伴招募另一种甲基转移酶DOT1L 并促使受MLL 调控的基因位点处的H3K79 异常高度甲基化，而H3K79 的甲基化是转录活跃的标志之一。DOT1L 是目前为止被发现的唯一一个催化组蛋白H3 中Lys79（H3K79）甲基化的甲基转移酶，其特点是不含其他甲基转移酶中特有的SET 结构域。DOT1L 已被认为是研究白血病的新的治疗药物的潜在靶点。最近，一类以EPZ-5676（22）为代表的小分子DOT1L 抑制剂已被报道。EPZ-5676 是甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的竞争性小分子抑制剂，与DOT1L 有很强的结合能力，并可以有效抑制H3K79的甲基化。体外细胞增殖抑制实验显示，EPZ-5676 对MV4-11 细胞系增殖的IC50 为3.5 nmol · L-1；前4 d 使细胞周期中处于G0/G1 期的细胞增加，而处于S 期的细胞减少，随后细胞凋亡。EPZ-5676 可以抑制由MLL1融合蛋白诱发的白血病细胞的生长，而对不含MLL 融合蛋白的细胞系没有影响，表明EPZ-5676 在癌细胞中的作用机制与MLL 融合蛋白密切相关。目前EPZ-5676已经进入Ⅰ期临床研究。需强调的是，DOT1L 在胚胎发育、造血和维护心脏功能方面都有重要作用，完全抑制DOT1L 的功能有可能产生严重的毒副作用。另外，SAM 是所有甲基化过程中的甲基供体，SAM 竞争性的化合物必然会面临选择性差的问题。生物学研究表明，DOT1L 可以与多个MLL 融合伙伴，如AF9、ENL 等相互作用。敲低ENL 或敲除DOT1L 均会降低位于HoxA9 基因位点的H3K79 的甲基化，并抑制带有MLL 重排基因的白血病细胞的生长。阻断MLL 融合蛋白与DOT1L 的相互作用，可以在不改变细胞中整体的H3K79 甲基化水平的情况下抑制血细胞的癌变。因此，阻断MLL 融合蛋白与DOT1L 相互作用是一种新的治疗带有MLL 重排基因的白血病的潜在方法。

尽管已发现的MLL 融合蛋白就超过70 种，但其中最主要的是MLL-AF9、MLL-ENL 和MLL-AF4 等3 种，大约70% 的MLL 白血病与这3 种融合蛋白有关。密歇根大学Nikolovska-Coleska 研究组对MLL融合蛋白MLL-AF9 和MLL-ENL 与DOT1L 的相互作用进行了详细的研究。首先，他们运用表面等离子体共振（SPR）的方法确定AF9 和ENL 能以1 : 1 的模式与DOT1L 结合，随后发现AF9 和ENL 与DOT1L 的结合是由这2 个蛋白C 端一个高度同源的结合口袋与DOT1L 中的一段短肽来调控。通过对这段源自DOT1L的多肽进行截断，发现含DOT1L 中的氨基酸残基865-874 的十肽（23）具有接近于DOT1L 蛋白的与AF9 和ENL 结合的能力，该十肽抑制MLL-AF9、MLL-ENL相互作用的IC50 值分别为0.49 和1.34 μmol · L-1。他们将合成的十肽用于DOT1L 与MLL 融合蛋白相互作用的研究，结果发现这个十肽可以有效阻断DOT1L 与MLL-AF9/ENL 的结合。

最近，Kuntimaddi 等利用核磁共振技术研究了MLL-AF9 与DOT1L 的相互作用。他们通过15N-1H HSQC 发现AF9 中的一个结构域（氨基酸序列499-568）可以跟DOT1L 中的3 个不同位置的多肽片段结合（见图1），其中片段1（site1）与AF9 的结合较弱，而片段2（site2，24）和片段3（site3）与AF9 的结合较强。同时，他们利用NMR 解析了AF9 与片段3 所形成的复合物的三维结构。值得注意的是，Nikolovska-Coleska 的研究组所发现的十肽就位于片段2 中，而且片段2 和3 中对与AF9 结合最重要的七肽片段（见图1，site2 和site3 中红色的片段）几乎完全相同，唯一不同的是在片段2 中这个七肽中的第3 个氨基酸是异亮氨酸，而在片段3 中对应的氨基酸是缬氨酸。在片段1 中同样有一个多肽片段具有与这个七肽类似的氨基酸组序列，因此这3 个片段很可能是以类似的构象与AF9 中的同一个区域结合。根据结构信息，他们设计了2 种定点突变的MLL-AF9 融合蛋白，这些突变的蛋白不能与DOT1L 有效结合，但是可以同野生型的融合蛋白竞争与受MLL 融合蛋白调控的基因位点结合，因此可以抑制野生型融合蛋白将DOT1L 招募到相关基因位点。在小鼠骨髓c-kit 细胞中表达这些定点突变的MLL 融合蛋白，可以明显抑制受MLL 融合蛋白调控的基因位点处H3K79 的双甲基化和三甲基化，并抑制Hoxa9 和Meis1 等基因的表达。以上研究进一步表明，阻断MLL-AF9 融合蛋白与DOT1L 的相互作用是一种潜在的治疗MLL 白血病的有效方法。目前还没有阻断MLL 融合蛋白与DOT1L 相互作用的小分子化合物报道，可以预见这将是新型MLL抑制剂研发的主要方向之一。

4 结语

MLL1 蛋白在生物体内起着十分重要的作用，染色体异位引发的MLL 融合蛋白会引起异常调控，继而导致MLL 白血病。随着对MLL1 的研究积累，MLL1 抑制剂不断被发现与改进，一些新的治疗MLL 白血病的小分子药物将走向成熟，为治疗白血病提供更多的方案。作用于WDR5 的小分子抑制剂已经表现出了很大的潜力；作用于Menin的MI 与MIV 系列化合物都在临床研究阶段；DOT1L 抑制剂中，SAM 模拟物有着一定的毒副作用，因而限制了其应用。通过干扰MLL1与DOT1L 相互作用的MLL1 抑制剂正在研发之中，目前报道最多的主要是肽类抑制剂，尚未见非肽类小分子抑制剂的出现。随着进一步的研究，更好的小分子MLL1 抑制剂还会出现，为MLL1 相关白血病的精准治疗提供更多选择。

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