乳腺癌液体活检技术应用进展

周金妹，史方浩，马　艳

胡志远，王　涛，江泽飞

军事医学科学院附属医院

国家纳米科学中心

　　新一代检测技术液体活检相较于传统的组织活检具有操作简便、可重复性好、非侵入性等优势。液体活检的主要检测对象包括肿瘤标志物、人表皮生长因子受体-2（HER2）蛋白胞外段（ECD）、循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA等。肿瘤标志物的检测基本已成为临床应用的常规，但特异性有待提高；循环肿瘤细胞CTC和循环肿瘤DNA检测是近几年新兴的检测方法，相关研究较多，但临床应用研究仍有待进一步大规模开展。本文将上述几种液体活检的技术和临床应用综述如下。

　　1　肿瘤标志物

　　糖类抗原15-3（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）是乳腺癌最传统的血清标志物，其检测简便易行，但由于其本身低敏感度和特异性的限制，目前除欧洲肿瘤标志物组织外，多数指南如美国肿瘤学会（ASCO）、欧洲肿瘤学会（ESMO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）均不推荐其常规检测用于诊断【1】，但是对于预后判断，CA15-3、CEA有一定的临床价值。Lee等【2-3】的研究表明，其是早期和晚期乳腺癌患者的独立预后因素。此外，根据笔者的临床经验，CA15-3、CEA的临床价值更好地体现在晚期乳腺癌患者治疗疗效的动态监测上，部分患者的肿瘤标志物连续监测，能够发现其病情变化和肿瘤标志物之间的相关性。二者检测水平的动态变化与治疗疗效具有相关性，在无目标病灶者中的临床价值更大，且CEA的临床价值在CA15-3检测值正常者中更为显著，当然目前多数专家共识仍建议其与其他临床指标联合应用【4】。临床中单独根据肿瘤标志物改变，而匆忙更换治疗方案也是不合适的。

　　2　HER2蛋白胞外段

　　HER2蛋白胞外段在金属蛋白酶的作用下脱落到外周血中，能被ELISA方法定量检测，是乳腺癌相对特异性的指标，主要用于HER2阳性乳腺癌，其临床价值体现在判断HER2状态、评估预后、预测疗效、动态监测病情等方面。关于ECD水平与组织学HER2状态相关性的研究所得结论并不一致，原因可能在于各个研究的入选患者、ECD检测方法、分界值等不同。Wang等【5】的研究显示，ECD水平与组织学HER2状态的一致性与患者治疗背景紧密相关，新辅助一致性最高、解救患者中等、辅助患者则无明显相关性，另外解救患者中实时检测的组织学HER2状态与ECD水平一致性更好。与组织学HER2阳性代表肿瘤侵袭性强、预后差一样，多数研究表明，ECD阳性患者无瘤生存（DFS）及总生存期（OS）较短【6-7】，化疗及内分泌治疗效果较差，总体有效率（ORR）低、无进展生存（PFS）时间短【8-10】。靶向药物曲妥珠单抗改善HER2阳性患者的预后，其作用靶点为HER2胞外段，因此ECD水平对其疗效有一定的预测价值。既往多数研究显示，治疗过程中ECD水平下降者疗效较好，但ECD下降的定义尚不明确，并且基线时ECD水平的疗效预测价值尚不明确【11-13】。Wang等【5】的研究采用FDA所批准的ECD分界值（15mg/L）、多数研究采用的动态变化定义（下降≥20%），结果显示，接受曲妥珠单抗治疗ECD阳性患者ORR低、PFS短、治疗过程中ECD下降≥20%者ORR高、PFS长。拉帕替尼是另一种靶向HER2药物，作用靶点为胞内段。Lee等【14】的研究表明，基线ECD值越高的患者接受拉帕替尼治疗相较于不接受拉帕替尼治疗PFS获益更明显，并且此趋势不受组织学HER2状态影响，未接受拉帕替尼治疗患者ECD水平高的PFS及OS短。Lipton等【15】的研究表明，接受拉帕替尼单药治疗患者治疗早期ECD检测值下降＞20%者ORR高、PFS延长。部分组织学HER2阴性患者ECD阳性。Ardavanis等【16】的研究显示，这类患者可能能从曲妥珠单抗治疗中获益。而Finn等【17】的研究则显示，该类患者未能从拉帕替尼治疗中获益。

　　总之，对于ECD在乳腺癌临床应用中的价值还有待商榷，因此，目前临床开展并不普及，其作用和价值还有待进一步挖掘研究。

　　3　循环肿瘤细胞

　　早在1869年，Ashworth【18】首次提出CTC的概念。CTC指从原发肿瘤上自发脱落的或诊断治疗过程中进入到外周血液循环中的肿瘤细胞。近年来，研究人员逐渐发现，CTC是引发肿瘤转移的主要原因，其在乳腺癌患者的肿瘤进程中发挥十分重要的作用。肿瘤细胞主要通过发生上皮-间质转换（EMT）使细胞具有迁移和侵袭的能力【19】。尽管进入到外周血液循环系统的CTC仅有很少一部分能够存活，但存活的CTC能够随血液抵达新的部位，并最终发展为转移灶。临床研究指出，乳腺癌转移确诊之前，就已发生癌细胞的血道转移，即CTC从原发肿瘤组织脱落并进入到血液循环之中，随着血液循环到达远处组织并进行种植、生长，最终形成转移病灶【20】。因此检出CTC并定量，对判断患者肿瘤负荷和指导临床治疗必将有重要意义。

　　CTC检测技术可分为细胞计数的检测方法和以核酸为基础的检测技术，其过程大致可以分为细胞的富集以及细胞的检测，现有的检测技术有流式细胞术、密度梯度离心、靶向PCR技术、CTC芯片、上皮细胞免疫斑点法、CellSearch等【21】。

　　3.1　CellSearch检测

　　CellSearch是唯一通过FDA认证的CTC检测系统。CellSearch目前也是在临床研究上运用最广泛的方法【22】。目前，其已通过中国、美国、欧盟等国家监管部门的批准，可以用来辅助转移性乳腺癌、结肠直肠癌及前列腺癌的监测。

　　肿瘤细胞多数来源于上皮细胞，因此肿瘤细胞也常带有上皮细胞所特有的表面抗原上皮细胞黏附分子（Ep-CAM）。CellSearch就是利用这个特点来实现CTC的富集。然后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和细胞角蛋白抗体对分离富集道德细胞进行染色，并通过白细胞共同抗原（CD45）抗体对比染色。最终，由于细胞含有细胞核，所以细胞角蛋白表达呈阳性，CD45表达呈阴性，并且直径＞5μm，才被认定为CTC。早在2004年的《新英格兰医学杂志》就发表文章证实，在7.5mL血液中，检出CTC细胞≥5个意味患者预后较差【23】。

　　3.2　CTC芯片技术

　　CTC芯片技术是一种微流控平台上的微芯片技术，可利用微柱包裹的Ep-CAM抗体，进而在精准控制的层流条件下在血液样本中分离CTC【24】。通过免疫磁性技术来捕获CTC芯片是通过微流控捕获CTC的一种新技术。通过免疫磁珠和CTC的成功结合从而捕获CTC，之后再通过一个微流装置来收集CTC。另有一种技术是将微流控技术与纳米材料相结合，构建一种肿瘤细胞表面特异性识别抗体功能化的鱼骨形芯片。在血液流经通道过程中，芯片可以形成一个微小的回旋，进而增强芯片与样本的接触。这种技术对血液样本的操作简便，且敏感度更高，重要的是富集的CTC有较好活性，可用来进行进一步分析检测。

　　3.3　靶向PCR的CTC检测技术

　　采用靶向PCR技术检测CTC，可以极大地提高CTC检测的敏感度。靶向PCR是将配体类似物交联核苷酸片段作为检测CTC的探针，通过细胞表面的特异性受体与其配体类似物的结合进而实现CTC与探针的结合，然后通过对探针的PCR定量检测计算CTC的数目【25】。靶向PCR的CTC检测技术具有高敏感度、易于临床应用和结果可重复等特点，有助于提高检测准确度，提升检测效率。

　　随着CTC检测技术发展迅速，已经研究出多种多样的检测方法，虽然这些新的方法可能在敏感度、特异性方面有更好的表现，但由于不同检测方法的敏感度和特异性的差异，未能实现标准化，所以很难对不同研究机构的检出结果进行对比。除此之外，使用单一的标志物来检测CTC，很可能出现漏检的情况。所以说，各种方法联合应用提高敏感度和特异性将成为检测CTC的趋势。

　　CTC的研究除在检测技术层面发展，提高检出率与准确率，在临床应用层面也在进行很多研究，确定其在临床应用的价值。CTC检测技术在乳腺癌的治疗监测和预后等方面的临床表现已经崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段，具有十分显著的临床应用价值。

　　在乳腺癌CTC治疗监测作用方面，评估转移性乳腺癌患者的治疗效果的常规方法为放射成像和外周血液中肿瘤标志物的检测等。但这些方法并不能满足及时评估的临床要求，因此建立新的评估治疗效果的检测方法是非常必要的。乳腺癌的临床研究指出，CTC的数量在化疗的第1个周期之后就已经发生改变，因此晚期乳腺癌患者的CTC动态变化可作为一种新的治疗监测工具【26】。对比传统的影像学方法，CTC检测有着高效、准确以及动态检测的优点。通过定期诊断，将CTC检测与影像学检查结合，可以更好地了解到患者的病情进展。此外，CTC可作为乳腺癌的预后因子。通过检测外周血液中的CTC，可以在发病早期推测其肿瘤细胞是否存在血行转移的可能性；还能通过血液中CTC的计数，对患者的远期预后进行评价。有研究表明，CTC是转移性乳腺癌的独立预后因子【27】：CTC监测数目越高，提示患者的预后越差。目前，CTC已成为对转移性乳腺癌的预后评估，可以作为PFS与OS相关的独立预测因素。

　　CTC的表型研究可能为乳腺癌个体化治疗作出更大贡献。HER2是乳腺癌常见的标志物之一。Hayashi等【28】通过CellSearch研究转移性乳腺癌患者的外周血CTCHER2阳性与预后的关系发现，治疗后外周血CTCHER2阳性患者比阴性患者的PFS（P=0.001）和OS（P=0.013）更短。临床上目前依据原发肿瘤组织学HER2的表达情况，来决定是否给予患者抗HER2的靶向治疗。是否未来CTC的HER2表型能帮助筛选合适的抗HER2靶向治疗患者，有待于进一步研究。在这方面，本研究中心也进行了相关探索【29】。临床上可以通过分析CTC的分子表观遗传学特征，进行相关的基因检测，筛选出适合患者的化疗、分子靶向药物，并确定治疗方案。CTC检测技术及分型技术应用将会促进个体化治疗的实施。这也是目前研究的热点。

　　CTC一个更为有意义的研究重点在于对肿瘤的早诊断或是复发的早期发现方面。这就要求提高CTC的检出率。CTC在血液中十分稀少，多数CTC在进入外周血之后会被吞噬或发生凋零，只有极少数能够逃逸并发展成为病灶。有报道指出，CTC在癌症早期就已出现。如果将CTC运用于癌症的早期诊断，或许能真正实现乳腺癌的及早发现、诊断和治疗。中科院纳米中心课题组应用最新的CTC分离技术———高特异性多肽纳米磁珠捕获和分离CTC技术，简称肿瘤捕手（TumorFisher）技术，用自主研发专利的特异多肽包被纳米级别的磁珠，去靶向识别和吸附肿瘤细胞，抗原为上皮细胞表面所具有的蛋白标志物，再通过磁场导向，筛选出被多肽识别的细胞。在Ⅱ期和Ⅲ期乳腺癌的初步试验中，检出率达到80%，临床价值值得期待。

　　乳腺癌CTC在乳腺癌治疗过程中有着十分重要的意义，可以运用于用药指导、疗效监控、病程分期、判断预后、个体化治疗以及复发预测等。相信随着研究人员对CTC的深入研究，CTC检测势必会成为临床肿瘤诊断、疗效评估和复发预测的有效手段，并最终纳入乳腺癌的常规检测方法。

　　4　循环肿瘤DNA（ctDNA）

　　ctDNA是由肿瘤细胞释放到血浆中的单链或双链DNA，携带有与肿瘤组织一致的分子遗传信息。ctDNA的半衰期一般＜2小时，明显短于其他如蛋白类的血液学肿瘤标志物，因此能更准确且实时地反映患者的肿瘤负荷；同时由于其高敏感度及特异性，可能具有反映微小残留病灶（MRD）的价值【30】。

　　4.1　ctDNA检测预测远期复发风险

　　Olsson等【31】回顾性分析20例乳腺癌患者术后连续监测ctDNA的价值，结果显示，其预测复发转移的敏感度和特异度分别为93%和100%，并且86%的患者ctDNA能提前预测复发转移，平均早于临床确诊复发转移11月。Garcia-Murillas等【32】前瞻性分析检测55例新辅助治疗患者治疗前原发灶的DNA突变情况，78%患者检测到≥1个体细胞突变，随后通过数字PCR技术动态监测这些患者新辅助治疗前、术后2－4周内、辅助治疗随访期间的ctDNA，结果显示，发生复发转移的患者中50%在术后第1次检测即检测到ctDNA，80%在动态随访期检测到≥1次ctDNA，并且平均早于临床影像确诊7.9月，剩余20%未检测到ctDNA的均为脑转移患者，其总体敏感度和特异性分别为80%和96%；此外动态监测ctDNA具有独立的预后价值，为更精确地根据肿瘤异质性制定个体化治疗提供依据。

　　4.2　晚期患者检测ctDNA能更早预测疗效

　　Schiavon等【33】应用高敏感度、高通量聚合酶链反应（PCR）技术检测171例激素受体阳性晚期乳腺癌患者ctDNA的雌激素受体α（ESR1）突变情况，结果显示ctDNA检测结果与同步的组织学检测结果高度一致，ctDNAESR1突变能预示患者对后续芳香化酶抑制剂（AI）治疗不敏感，PFS时间短于非突变患者。相关通过检测ctDNA突变预测耐药的研究也很多。

　　ctDNA检测研究仍处于如火如荼的探索阶段，相关研究很多，但大样本量前瞻性研究还缺乏，如何指导临床实践还需等待研究结果。

　　液体活检技术是临床诊治的发展方向，能够帮助医生在早诊断、早治疗方面实现突破，同时能够指导临床方案的制定，实现真正的个体化精准医疗。

参考文献

1. Ravelli A, Reuben JM, Lanza F, et al. Breast cancer circulating biomarkers: advantages, drawbacks, and new insights. Tumour Biol. 2015;36(9):6653-6665.

2. Lee JS, Park S, Park JM, et al. Elevated levels of preoperative CA 15-3 and CEA serum levels have independently poor prognostic significance in breast cancer. Ann Oncol. 2013;24(5):1225-1231.

3. Lee JS, Park S, Park JM, et al. Elevated levels of serum tumor markers CA 15-3 and CEA are prognostic factors for diagnosis of metastatic breast cancers. Breast Cancer Res Treat. 2013;141(3):477-484.

4. Sturgeon CM, Duffy MJ, Stenman UH, et al. National Academy of Clinical Biochemistry laboratory medicine practice guidelines for use of tumor markers in testicular, prostate, colorectal, breast, and ovarian cancers. Clin Chem. 2008;54(12):e11-79.

5. Wang T, Zhou J, Zhang S, et al. Meaningful interpretation of serum HER2 ECD levels requires clear patient clinical background, and serves several functions in the efficient management of breast cancer patients. Clin Chim Acta. 2016;458:23-29.

6. Ludovini V, Gori S, Colozza M, et al. Evaluation of serum HER2 extracellular domain in early breast cancer patients: correlation with clinicopathological parameters and survival. Ann Oncol. 2008;19(5):883-890.

7. Fehm T, Jger W, Krmer S, et al. Prognostic significance of serum HER2 and CA 15-3 at the time of diagnosis of metastatic breast cancer. Anticancer Res. 2004;24(3b):1987-1992.

8. Colomer R, Llombart-Cussac A, Lluch A, et al. Biweekly paclitaxel plus gemcitabine in advanced breast cancer: phase II trial and predictive value of HER2 extracellular domain. Ann Oncol. 2004;15(2):201-206.

9. Muller V, Witzel I, Luck HJ, et al. Prognostic and predictive impact of the HER-2 /neu extracellular domain (ECD) in the serum of patients treated with chemotherapy for metastatic breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2004;86(1):9-18.

10. Lipton A, Ali SM, Leitzel K, et al. Elevated serum Her- 2 /neu level predicts decreased response to hormone therapy in metastatic breast cancer. J Clin Oncol. 2002;20(6):1467-1472.

11. Ali SM, Carney WP, Esteva FJ, et al. Serum HER-2 /neu and relative resistance to trastuzumab-based therapy in patients with metastatic breast cancer. Cancer. 2008;113(6):1294-1301.

12. Esteva FJ, Cheli CD, Fritsche H, et al. Clinical utility of serum HER2 /neu in monitoring and prediction of progression- free survival in metastatic breast cancer patients treated with trastuzumab-based therapies. Breast Cancer Res. 2005;7(4):R436-443.

13. Fornier MN, Seidman AD, Schwartz MK, et al. Serum HER2 extracellular domain in metastatic breast cancer patients treated with weekly trastuzumab and paclitaxel: association with HER2 status by immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization and with response rate. Ann Oncol. 2005;16(2):234-239.

14. Lee CK, Davies L, Gebski VJ, et al. Serum human epidermal growth factor 2 extracellular domain as a predictive biomarker for lapatinib treatment efficacy in patients with advanced breast cancer. J Clin Oncol. 2016;34(9):936-944.

15. Lipton A, Leitzel K, Ali SM, et al. Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) extracellular domain levels are associated with progression-free survival in patients with HER2-positive metastatic breast cancer receiving lapatinib monotherapy. Cancer. 2011;117(21):5013-5020.

16. Ardavanis A, Kountourakis P, Kyriakou F, et al. Trastuzumab plus paclitaxel or docetaxel in HER-2-negative / HER-2 ECD-positive anthracycline- and taxane-refractory advanced breast cancer. Oncologist. 2008;13(4):361-369.

17. Finn RS, Gagnon R, Di LA, et al. Prognostic and predictive value of HER2 extracellular domain in metastatic breast cancer treated with lapatinib and paclitaxel in a randomized phase III study. J Clin Oncol. 2009;27(33):5552-5558.

18. Ashworth T. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Med J Aust. 1869;14:146.

19. Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(3):178-196.

20. Krebs MG, Metcalf RL, Carter L, et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 2014;11(3):129-144.

21. 黄红艳, 江泽飞. 循环肿瘤细胞在乳腺癌中的研究进展. 国际肿瘤学杂志. 2011;38(7):516-518.

22. Bredemeier M, Edimiris P, Tewes M, et al. Establishment of a multimarker qPCR panel for the molecular characterization of circulating tumor cells in blood samples of metastatic breast cancer patients during the course of palliative treatment. Oncotarget. 2016;7(27):41677-41689.

23. Cristofanilli M, Budd G, Ellis M, et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 2004;351(8):781.

24. Stott SL, Hsu CH, Tsukrov DI, et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone- chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(43):18392-18397.

25. Lou J, Ben S, Yang G, et al. Quantification of rare circulating tumor cells in non-small cell lung cancer by ligand- targeted PCR. PLoS One. 2013;8(12):57.

26. Ignatiadis M, Mavroudis D. Circulating tumor cells in breast cancer. Mol Oncol. 2016;423(12):39-45.

27. Pierga JY, Hajage D, Bachelot T, et al. High independent prognostic and predictive value of circulating tumor cells compared with serum tumor markers in a large prospective trial in first-line chemotherapy for metastatic breast cancer patients. Ann Oncol. 2012;23(3):618-624.

28. Hayashi N, Nakamura S, Tokuda Y, et al. Prognostic value of HER2-positive circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer. Intelligence, 2012;33(4):393-416.

29. Yi Liu, Qian Liu, Tao Wang, et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 2013;13:202.

30. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra24.

31. Olsson E, Winter C, George A, et al. Serial monitoring of circulating tumor DNA in patients with primary breast cancer for detection of occult metastatic disease. EMBO Mol Med. 2015;7(8):1034-1047.

32. Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, et al. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci Transl Med. 2015;7(302):302ra133.

33. Schiavon G, Hrebien S, Garcia-Murillas I, et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Sci Transl Med. 2015;7(313):313ra182.

原文参见：实用肿瘤杂志. 2016;31(5):414-418.