阿法替尼对人乳腺癌细胞增殖与凋亡的影响及机制研究

赵颖，迟江瑞，赵洪猛

张斌，曹旭晨，余岳　

天津医科大学天津市肿瘤医院

国家肿瘤临床医学研究中心　

天津市肿瘤防治重点实验室　

恶性肿瘤临床医学研究中心　

乳腺癌防治教育部重点实验室

　　目的：探讨酪氨酸激酶抑制剂（TKI）阿法替尼对乳腺癌细胞增殖、周期及凋亡的影响，并就阿法替尼与吉非替尼对乳腺癌细胞的作用进行比较。

　　方法：应用MTT法检测人乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDAMB-231细胞活性，流式细胞术的PI染色法检测细胞周期变化以及膜联蛋白-V/PI双染法检测细胞凋亡，通过蛋白质印迹法检测蛋白表达情况。

　　结果：阿法替尼对MCF-7、T47D、MDA-MB-231细胞均有明显的抑制作用，IC50分别为0.101、0.141、0.887μmol/L。阿法替尼对T47D、MDA-MB-231细胞作用24h后G0/G1期细胞比例明显升高，细胞凋亡率增加，晚期的凋亡率分别为88.9%、58.1%，并可促进细胞凋亡通路蛋白PARP、胱天蛋白酶-3发生剪切。阿法替尼、吉非替尼使MDA-MB-231细胞的EGFR磷酸化水平受到明显抑制，相同浓度下，阿法替尼作用较吉非替尼更强、持续时间更长。

　　结论：阿法替尼可显著抑制乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡，且具有明显的量效关系，较吉非替尼具有更有效的作用。

通信作者：曹旭晨（[e-mail]）

原文参见：中国肿瘤临床. 2017;44(15):739-743.

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　　阿法替尼为EGFR、HER2的非可逆双靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI），可与EGFR的Cys773位点及HER2的Cys805位点结合。阿法替尼已于2013年通过美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗EGFR突变阳性非小细胞肺癌，而对乳腺癌作用的研究较少。本研究旨在研究阿法替尼对乳腺癌细胞的作用，并与单靶点EGFR可逆性TKI吉非替尼进行比较。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　阿法替尼、吉非替尼购自美国Selleck Chemicals公司；RPMI1640、DMEM基础培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；膜联蛋白V/PI试剂盒购自美国BD Pharmingen公司；EGFR、磷酸化EGFR、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、胱天蛋白酶-3抗体均购自美国Cell Signaling公司。人乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231由天津市肿瘤研究所提供。

　　1.2　方法

　　1.2.1　细胞培养

　　MCF-7、T47D细胞由含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的RPMI1640培养液培养，MDA-MB-231细胞由含10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的DMEM基础培养液培养。细胞均置于37℃、5%CO2的细胞培养箱培养。

　　1.2.2　MTT法检测

　　取对数生长期的细胞进行细胞活性检测，调整细胞密度为50/L，接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，将不同抑制剂按照不同浓度梯度加入96孔细胞培养板（200μL/孔），以含等体积浓度DMSO的细胞培养液作为对照。每组设3个复孔。不同抑制剂作用24h后，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，孵育4h，离心弃上清。每孔加入DMSO200μL，震荡10min。酶联免疫检测仪检测570nm波长各孔的吸光度（OD）值。参照文献【1】，计算不同抑制剂对细胞的抑制率，采用Excel绘制抑制率曲线分别计算半数抑制浓度（IC50）值。细胞的抑制率=（D对照组-D实验组）/D对照组×100%。

　　1.2.3　流式细胞术检测

　　取对数生长期的细胞进行细胞周期检测，调整细胞密度为1000/L，接种于6孔细胞培养板。细胞贴壁后，将不同抑制剂按照不同浓度梯度加入6孔细胞培养板，以含等体积浓度DMSO的细胞培养液作为对照。不同抑制剂作用24h后收集细胞，使用4℃预冷PBS缓冲液洗涤2次，离心弃上清。加入冰预冷的70%乙醇4℃固定2h。离心弃上清，PBS缓冲液洗涤1次，离心弃上清，加入1mLPI染液避光孵育10min，于流式细胞仪进行细胞周期检测。取细胞重悬于结合缓冲液。各组分别取100μL细胞悬液至5mL测试管中，分别加入5μL的膜联蛋白V标记液和5μL的PI，避光室温孵育15min，加入500μL结合缓冲液，4℃静置30min，于流式细胞仪进行细胞凋亡测定。

　　1.2.4　蛋白质印迹法

　　细胞处理后，使用4℃预冷的PBS缓冲液洗涤3次，弃上清，加入细胞裂解液，冰上静置30min，收集细胞裂解液，4℃下12000r/min离心5min后收集上清，95℃加热15min。利用分光光度计测定蛋白浓度，加入相应体积加样缓冲液，95℃加热10min。每组取40μg蛋白于10%SDS-PAGE中进行蛋白电泳，电泳后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶室温孵育1h，将硝酸纤维素膜置于一抗稀释液中4℃孵育过夜。用含0.1%吐温20的PBS缓冲液洗涤3次，置于二抗稀释液中室温孵育1h，再次使用含0.1%吐温20的PBS缓冲液洗涤3次。加入化学底物发光液，暗室曝光、显影、定影。

　　1.3　统计学分析

　　采用SPSS16.0软件进行统计学分析。各组数据以x±s表示，采用单变量方差分析进行多组间比较，各组数据间两两比较采用邦弗朗尼多重比较事后检验校正的t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　乳腺癌细胞系EGFR、HER2表达

　　通过蛋白质印迹法检测MDA-MB-231、MCF-7、T47D细胞中EGFR、HER2表达情况，结果提示MDA-MB-231、T47D细胞中EGFR阳性、HER2阴性，而MCF-7细胞中EGFR弱阳性、HER2阳性（图1）。

图1　MDA-MB-231、MCF-7、T47D细胞EGFR、HER2表达情况

　　2.2　阿法替尼、吉非替尼对乳腺癌细胞增殖的影响

　　MTT法检测结果显示，在MDA-MB-231、MCF-7、T47D三种乳腺癌细胞系中，MCF-7、T47D细胞对阿法替尼的抑制作用最为敏感，IC50分别为0.101、0.141μmol/L，MDA-MB-231细胞的增殖也可明显被阿法替尼抑制（IC50=0.887μmol/L）。与阿法替尼相比，三种乳腺癌细胞系对吉非替尼的敏感性均较差，T47D、MDA-MB-231细胞IC50分别为10.375、19.340μmol/L，均表现出良好的量效关系，而MCF-7细胞对吉非替尼耐药，IC50>20μmol/L（图2）。

图2　不同浓度阿法替尼、吉非替尼对乳腺癌细胞系抑制率曲线

　　2.3　阿法替尼、吉非替尼对乳腺癌细胞周期的影响

　　通过流式细胞术测定阿法替尼、吉非替尼对T47D、MDA-MB-231细胞周期的影响。结果表明阿法替尼、吉非替尼作用T47D、MDA-MB-231细胞后，G0/G1期细胞比例明显升高，S期及G2期细胞明显减少，阿法替尼较吉非替尼的抑制作用明显增强（图3）。

图3　阿法替尼、吉非替尼对乳腺癌细胞周期的影响

　　2.4　阿法替尼、吉非替尼对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

　　流式细胞术膜联蛋白V/PI双染法检测阿法替尼、吉非替尼对T47D、MDA-MB-231细胞凋亡的影响。结果表明1μmol/L吉非替尼作用T47D、MDA-MB-231细胞后，早期的凋亡率分别为54.6%、60.4%，晚期的凋亡率分别为21.4%、12.4%；1μmol/L阿法替尼作用T47D、MDA-MB-231细胞后，早期的凋亡率分别为6.0%、24.3%，晚期的凋亡率分别为88.9%、58.1%（图4）。

图4　阿法替尼、吉非替尼对乳腺癌细胞凋亡的影响

　　2.5　阿法替尼、吉非替尼对EGFR磷酸化水平及凋亡通路的影响

　　通过蛋白质印迹法检测阿法替尼、吉非替尼对MDA-MB-231细胞的EGFR磷酸化水平的影响及持续效果显示，10μmol/L的阿法替尼、吉非替尼对MDA-MB-231细胞作用3h后，经100nmol/L表皮生长因子（EGF）刺激10min，EGFR磷酸化水平受到明显抑制。洗脱后6h，经100nmol/LEGF刺激10min，阿法替尼处理组的EG-FR磷酸化水平仍受到明显抑制，而吉非替尼处理组的EGFR磷酸化水平明显升高（图5A）。蛋白质印迹法检测阿法替尼、吉非替尼对T47D、MDA-MB-231细胞凋亡通路蛋白PARP、胱天蛋白酶-3的影响结果表明，1μmol/L的阿法替尼、吉非替尼均可促进细胞凋亡通路蛋白PARP、胱天蛋白酶-3发生剪切，而相同浓度的阿法替尼较吉非替尼作用更强（图5B）。

图5　阿法替尼、吉非替尼对EGFR磷酸化水平及凋亡通路的影响

　　3　讨论

　　目前，曲妥珠单抗靶向治疗已成为HER2阳性乳腺癌的标准治疗【2】。但对于HER2阴性乳腺癌，尤其是三阴性乳腺癌，尚未发现明确有效的治疗靶点【3】。尽管HER2阳性及管腔型乳腺癌对于曲妥珠单抗及内分泌治疗具有较好的疗效，但耐药仍是其治疗的棘手问题【4】。因此，寻找有效的靶点及新的靶向治疗药物成为乳腺癌研究的热点。在肺癌、头颈部肿瘤及胶质母细胞瘤等肿瘤中，EGFR的作用受到广泛关注【5】，乳腺癌中14%～91%为EGFR高表达【6】，而EGFR高表达与肿瘤的进展及预后密切相关【7】。尤其是在复发转移常见、预后最差的三阴性乳腺癌中，50%以上患者的EGFR表达呈阳性【8】。因此，针对EGFR的靶向治疗可能为乳腺癌治疗带来新的希望。吉非替尼是一种EGFR-TKI，可通过竞争性结合ATP抑制EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化，从而阻断下游信号的传递。在肺癌治疗中吉非替尼已得到广泛的应用，并取得了一定的疗效【9】。对经其他治疗的转移性乳腺癌患者，吉非替尼的Ⅱ期临床试验的早期结果未显示有效性，尤其是对曾行化疗的患者【10】。因此，在乳腺癌中对吉非替尼的原发性耐药可能普遍存在。阿法替尼是第二代高效双重非可逆性的TKI，可与EGFR的Cys773位点及HER2的Cys805位点进行不可逆结合，从而阻断下游信号转导【11】。目前，阿法替尼已用于非小细胞肺癌治疗，但在乳腺癌治疗中的应用仍在研究之中。

　　本研究通过MTT法检测表明，阿法替尼可显著抑制乳腺癌细胞的活性，且具有明显的量效关系。通过流式细胞术检测细胞周期发现，阿法替尼可抑制乳腺癌细胞于G0/G1期，从而阻断乳腺癌细胞的增殖。Schütze等【12】研究了阿法替尼对人鳞状细胞癌的作用发现，阿法替尼同样可阻滞癌细胞于G0/G1期，并且有一定的放疗增敏作用。阿法替尼可通过不可逆结合EGFR及HER2受体，抑制其磷酸化，而PI3K/Akt是生长因子受体重要的下游信号分子，可促进细胞周期的进程。因此，阿法替尼主要通过抑制EGFR/PI3K/Akt通路信号转导进而发挥抑制癌细胞增殖的作用【13】。胱天蛋白酶-3是细胞凋亡信号通路中重要的凋亡执行分子，PARP是一种DNA修复酶，可被胱天蛋白酶-3剪切而失活，为胱天蛋白酶-3激活的重要指标。本研究进一步通过膜联蛋白V/PI双染法发现，阿法替尼阻断乳腺癌细胞增殖后诱导细胞凋亡，阿法替尼促进乳腺癌细胞胱天蛋白酶-3及PARP的剪切。因此，阿法替尼可通过胱天蛋白酶途径促进细胞凋亡。

　　阿法替尼的药物作用较吉非替尼有以下优势：①作用癌细胞广泛：因阿法替尼是一种多靶点抑制剂，因此可针对多种乳腺癌细胞类型；②作用相应更强：相较于吉非替尼，阿法替尼IC50更低，相同浓度下其对癌细胞抑制作用更显著；③作用时间更久：因阿法替尼是一种不可逆的抑制剂，其信号阻断时间更长，经洗脱后仍可抑制EGFR的磷酸化。Ninomiya等【14】利用小鼠肺癌模型，比较阿法替尼与吉非替尼的药物作用，研究结果发现阿法替尼可显著延长小鼠的存活时间，验证了阿法替尼较吉非替尼的治疗优势。

　　综上所述，阿法替尼可抑制乳腺癌细胞增殖，促进其凋亡，相较吉非替尼具有更有效的作用。因此，阿法替尼对于乳腺癌治疗可能具有较好的前景，但需要进一步的临床试验验证。

参考文献

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