张兴栋院士/孙勇研究员/樊渝江教授《自然·通讯》：即时可修复、自适应支架通过自体干细胞募集和血管生成用于颅骨再生

由脑外伤引起的大型颅面骨缺损的重建仍然具有很大的挑战性。目前，使用自体/同种异体移植物的重建手术的骨采集成本高、骨源有限，以及可能引发供体部位并发症。此外，传统颅骨成形术中的附属装置，例如颅骨锁或骨钉，增加了手术的复杂性和成本。因此，可以在颅骨切除术后立即植入并固定在缺损部位的功能性植入物可能为适应颅内微环境和动员内源性干细胞用于颅组织再生带来新的前景。颅面骨主要通过膜内骨化形成，其中间充质细胞直接分化为成骨细胞，随后发育为有机/无机混合交联松质骨结构。颅面骨重新出现的结构和组成可能为干细胞的迁移、浸润、增殖和分化创造适当的必要环境。颅骨的形成与毛细血管的进化相吻合，毛细血管会产生高度血管化的组织，以便及时供应氧气和营养，以维持骨骼发育、整合和体内平衡。也就是说，成骨和血管生成之间的密切联系对于颅骨形成至关重要。然而，目前的颅骨再生策略往往无法产生高度血管化的新骨骼。

鉴于此，四川大学国家生物材料工程研究中心孙勇研究员、樊渝江教授、张兴栋院士合作开发了用于颅骨再生的即时可修复和自适应支架，以高度模拟天然骨基质。它通过钙螯合表现出良好的机械匹配和界面整合，并通过柔性变形响应外部应力。同时，适当的基质微环境调节巨噬细胞M2 极化并募集内源性干细胞。该支架在体外促进骨髓基质细胞的增殖和成骨分化，以及显着的异位矿化和血管生成。转录组分析证实相关基因和信号通路的上调与M2巨噬细胞活化、内源性干细胞募集、血管生成和成骨相关。另外，在兔（Φ = 9 mm）和比格犬（Φ = 15 mm）的颅骨缺损模型中使用支架12周后，可以分别实现97%和72%的骨覆盖区域。相关实验结果发表于《Nature Communications》。

图1 | 仿生多巴胺介导的混合交联支架（HCLS）通过在缺损区域的即时无缝粘附，以及内源性干细胞的募集和保留，快速启动骨生成和血管生成，实现颅骨重建。植入12周后，HCLS可以实现骨再生，在颅骨缺损部位，兔模型的骨覆盖面积为97%，比格犬模型为72%。

在这项工作中，多巴胺修饰的透明质酸（HAD）被用作“桥梁”，以螯合微米羟基磷灰石（µHap） 的Ca²⁺并通过迈克尔加成反应结合 I 型胶原蛋白(Col I)。该策略有效地在分子水平上将有机相和无机相进行强化学连接，形成混合交联支架（HCLS），模拟天然骨细胞外基质的构建。

图2 |工程自粘和柔性多孔混合交联支架的合成和表征。

另外，作者在体外评估了支架的免疫反应。HCLS的扫描电镜图发现了丰富的长伸展距离的丝状伪足。定量结果显示HCLS上的扩散面积和细胞纵横比更高，这意味着µHAp促进了细胞扩散。免疫荧光染色的Image J半定量荧光强度显示HCLS表现出更高的CD206⁺（高度特异性的M2型标记）和更低的CD197⁺表达（高度特异性的M1型标记）。H&E分析显示，小鼠肌肉植入后第7天，炎性细胞浸润主要集中在HCLS外周。在第14天发现纤维组织穿透到植入物的内部区域。在HCLS中观察到大量细胞，具有更高的扩散面积和细胞纵横比。流式细胞仪数据表明HCLS中的巨噬细胞水平低于DCLS中的巨噬细胞水平，并且随着时间的推移而降低。HCLS募集了更多的M2巨噬细胞（CD197^- CD206⁺ 细胞）和更少的 M1巨噬细胞（CD197⁺ CD206^- 细胞）。使用ELISA检查体内免疫相关细胞因子以进一步研究炎症反应。与DCLS相比，HCLS下调促炎细胞因子（TNF-α和IL-1β），上调抗炎细胞因子（IL-4、IL-10和IL-1rα），并且这种作用随着时间的推移变得更加明显。免疫荧光染色进一步证实HCLS比DCLS更有利于巨噬细胞从M1到M2的转变。巨噬细胞在第7天在空间上分布在植入物周围，而更多的巨噬细胞在第14天渗透到植入物中。

巨噬细胞可通过分泌骨诱导和血管诱导因子（如BMP-2和VEGF）作为骨生成和血管生成的有效诱导剂来介导骨和血管再生。应用免疫荧光染色来探索HCLS是否有助于成骨和血管生成。发现大多数内源性VEGF和BMP-2与F4/80⁺ 植入物中出现巨噬细胞。DCLS和HCLS的表达水平均随时间增加，但HCLS的荧光强度明显高于DCLS。类似的现象发生在兔颅骨缺损模型中。值得注意的是，HCLS在植入7天后表现出更强的促炎特性（CD197⁺ CD206^-），但在第14天炎症明显减少。据报道，伤口修复早期的炎症有利于炎症细胞、生化因子、和骨祖细胞。因此，由HCLS诱导的更高BMP-2和VEGF分泌可归因于极化的M2表型巨噬细胞。

图3 | 支架在小鼠肌肉和兔颅骨缺损模型中的体内免疫反应。

将骨髓基质细胞 (BMSCs) 封装在水凝胶中并培养14天以评估其增殖和分化。活/死染色表明HAD促进了细胞的均匀扩散，胶原蛋白的引入增加了细胞粘附，并且HCLS中的交联 μHAp提高了视觉细胞密度。CCK-8结果证实，所有水凝胶都能不同程度地促进BMSC增殖，而HCLS组表现最好。细胞骨架染色的CLSM图像和SEM图像的BMSCs表明，多巴胺的引入增加了细胞粘附和扩散，细胞核（蓝色）周围有高度拉长的肌动蛋白丝（红色）。有趣的是，VEGF和BMP-2的免疫组化染色表明HCLS组有较大面积的阳性染色均匀分布；半定量结果验证了最佳的BMP-2分泌。此外，Runx2、骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）的特异性成骨基因表达水平随时间逐渐上调，并且HCLS中的相关表达水平显着高于其他组。为了模拟骨基质沉积和矿化，将载有BMSC的水凝胶皮下植入裸鼠体内30天。0.95的尺寸变化率证明了BMSC负载HCLS在体内的结构稳定性。有趣的是，HCLS的储能模量（103 ± 8 kPa）几乎是其初始值的五倍，暗示HCLS内有丰富的骨基质沉积和矿化。磷灰石体积 (AV) 和磷灰石体积相对于总体积 (AV/TV) 的定量分析证实，更多的磷灰石沉积在HCLS中。外植体的SEM图像显示多孔结构和缠结的纤维网络。特别是，一些平均尺寸约为200 nm 的矿物纳米粒子均匀地嵌入到HCLS中的缠结纤维束中，这与天然骨基质结构高度相似。Runt 相关转录因子2 (Runx2) 是骨形成所必需的特异性转录因子，可调节BMSCs分化为成骨细胞，抑制其分化为软骨细胞和脂肪细胞，并上调基质基因（OCN、Col I 等）的表达。通过免疫荧光染色（IF）在 DCLS、HCLS 和 HAD 组中观察到阳性Runx2。半定量分析进一步证明了HCLS组中Runx2的最高表达，反映了其骨诱导潜力。骨缺损愈合是一个动态的祖细胞驱动的组织形态发生过程，需要在修复部位协调成骨和血管生成。因此，骨再生的成功也取决于血管化。有趣的是，外植体周围可见血管，观察到VEGF和内皮细胞标志物（CD31）明显阳性染色，表明新的血管形成可能与HAD密切相关。此外，HCLS中VEGF和CD31的阳性表达显着增强，这意味着μHAp的引入加速了血管生成。

图4 | 富含 BMSCs的HCLS的体内骨分化和异位矿化。

通过将整个兔颅骨骨髓细胞悬液孵育48小时来确定HCLS在体外对BMSCs 的募集。彻底冲洗支架以去除非粘附细胞。接下来，BMSCs用F-肌动蛋白和细胞表面糖蛋白 (CD44) 染色，用作鉴定干细胞表型的特征标记。CD44染色强度和细胞形态表明HCLS中干细胞的最佳募集能力，以及粘附干细胞的显着更高的扩散区域。随后，进行了跨孔迁移试验以研究支架对BMSCs的迁移诱导作用。与其他水凝胶相比，HCLS可以更有效地调动BMSCs的定向迁移和侵袭。

图5 | HCLS募集内源性干细胞。

DCLS和HCLS均精确匹配骨缺损，并在新西兰白兔植入4周后与宿主骨组织密切接触，而大量新骨组织良好。缺损部位横截面的SEM图像显示，HCLS中新骨组织的厚度从0.9 mm 变为1.5 mm，而其他组没有明显变化。HCLS中致密光滑的界面表明良好的骨整合能力。然后进行推出测试以评估宿主和新骨之间的界面结合力。植入12周后，HCLS组推出试验的断裂载荷从36.7 N增加到68.5 N，接近正常值（80.5 N）。

图6 | 在兔颅缺损模型中DCLS和HCLS增强的原位颅骨再生。

将HCLS植入具有完整脑膜的比格犬的颅骨缺损（Φ = 15 mm）中。HCLS的射线照相图像显示新的骨组织与宿主骨紧密结合。micro-CT的代表性3D图像表明，在植入后12周，空白组中没有发现明显的新形成的骨。甚至观察到骨量减少，这可能是由于手术过程中高速球铣刀热损伤引起的局部骨坏死的骨吸收。然而，在HCLS组中发现新生骨组织逐渐增加。定量分析进一步证实，HCLS组的BV/TV值、新骨量和新骨覆盖率表明HCLS促进了比格犬的颅骨再生。

图7 | 在比格犬模型中通过HCLS激活血管生成和成骨重建颅骨。

综上，作者开发了一种即时可固定和自适应的支架，它模仿颅骨基质的组成和结构，以促进宿主血管化成骨。HCLS的独特之处在于Col I纳米纤维表面、μHAp颗粒和HAD水凝胶网络之间的混合交联键。这种结合为提高支架的结构稳定性和组织粘附能力提供了一种有效的方法，具有相对较高的孔隙率和相互连接的多孔结构，有助于细胞浸润、血管化和组织重塑。HCLS在体内植入7天后实现了令人满意的界面整合，并确保了内源性干细胞向支架的侵袭、浸润和迁移。该策略可能代表了一种广泛考虑的无细胞/无因子再生策略，有望为颅再生提供有意义的临床替代方案。

来源：高分子科学前沿

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