如何标记观察3D培养过程中的活细胞状态？

细胞3D培养过程中往往需要监测细胞在基质材料/结构内的实时变化，比如：如何观察水凝胶内不同类型细胞的形态？如何长时间监测3D打印支架内活细胞的生长变化？如何监测器官芯片体系中细胞的实时状态？常规的鬼笔环肽骨架染色、石蜡切片染色等都是将细胞固定后再染色，这样细胞便无法再进行后续培养，解决的办法只有设置多个平行组在不同阶段进行固定染色，需要大量样本，成本高，工作量大。

活细胞示踪探针CellTracker经常被用于观察三维培养环境中细胞的形态及行为。CellTracker通过穿透细胞膜进入活细胞，生成发出特定荧光的荧光素，能完好保留在胞内，且信号非常稳定。另外，CellTracker在细胞分裂的过程中可传给子代细胞，且不会影响邻近细胞，因此荧光信号保留时间较长。具体使用方法:将细胞与特定荧光的CellTracker探针孵育一段时间，通过标记上的不同颜色荧光，在激光共聚焦显微镜下追踪监测细胞的行为。

本期EFL将通过几个案例带大家了解活细胞示踪探针CellTracker在3D细胞培养研究中的应用。

案例一

通过CellTracker观察细胞在GC-MS+NGF/GelMA复合支架中细胞生长的情况

图1 多尺度GC-MS+NGF/GelMA复合支架的载细胞生物打印，PC12细胞和RSC96细胞分别用CellTracker Green和CellTracker Orange标记^[1]

本文研究人员对GC-MS+NGF/GelMA生物墨水进行挤出式生物3D打印，构建周围神经组织网络的多尺度复合支架，并在生物墨水中加载PC12和RSC96两种细胞进行载细胞打印，以研究该多尺度复合支架对神经细胞的影响。由于复合支架中存在两种不同的细胞，其在支架内生长、迁移、增殖分化的情况都可能不同，那么如何观察这两种细胞在支架内活细胞的生长状况及形态呢？

研究人员使用5mM CellTracker Green CMFDA探针和5mM CellTracker Orange CMTMR探针分别对PC12细胞和RSC96细胞进行标记，再进行复合水凝胶载细胞生物3D打印，从而实现长时间观察这两组细胞在GC-MS+NGF/GelMA复合支架内的生长情况和形态变化。标记结果如图1所示：经CellTracker示踪后，绿色的PC12细胞和红色的RSC96在GC-MS+NGF/GelMA支架中均匀分布，培养24小时之后，两组细胞均标记清晰，长势良好。由此可见，使用CellTracker标记细胞能很好地对复合支架内的多种细胞进行观察。

案例二

CellTracker在细胞定向研究中的长时间监测

图2 光控细胞定向过程中的研究，绿色和红色均为CellTracker标记^[2]

本文研究人员在TiO2纳米点薄膜上构建光控定向细胞片，可实现对细胞方向性排列的操控，对细胞方向性的行为研究需要长时间对细胞的进行可视化监测追踪，若采用传统的固定染色技术进行观察，显然很难进行研究。

研究人员使用1µM CellTracker Green CMFDA和1µM CellTracker Red CMTPX对细胞进行预标记30min，追踪细胞行为。如图2所示，实验组的掩膜中载入的绿色细胞在12h后可以观察到细胞条带状排列；对照组红色细胞排列无序；在5天后，实验组绿色细胞仍保持方向性，对照组的红色细胞排列呈巢状。由此可见，CellTracker探针适用于对细胞行为的长时间观察。

案例三

CellTracker在体外可蠕动肠－血管模型中的应用 

图3  芯片上的大肠杆菌引起的肠道损伤和炎症反应^[3]

本文研究人员设计了一个层叠式三腔室芯片模型，具体是由两个血管腔夹着一个肠腔，在肠腔引入肠道微生物，在血管腔引入巨噬细胞构建一个复杂的多细胞共培养体系。该微流控器官芯片可实精确模拟肠腔和血管腔的机械物理环境，但是面对如此复杂的多细胞器官芯片培养体系，应该如何进行活性细胞的动态监测？

研究人员通过10mM CellTracker^TM Blue CMPTX标记肠上皮细胞，通过10mM CellTracker^TM Green CMFDA标记血管内皮细胞，用5mM CellTracker^TM Red CMPTX标记大肠杆菌和干酪乳杆菌。图3结果显示：通过CellTracker标记后绿色的血管内皮细胞、蓝色的肠上皮细胞与红色的肠道微生物在微流控芯片的动态培养体系下相互作用。这也显示出CellTracker作为细胞示踪剂，可很好地应用在多细胞动态培养体系。

以上是关于CellTracker在3D细胞培养中的一些应用介绍，我们不难发现，不管是观察多尺度支架内细胞的生长状况，连续5天长时间监测细胞的行为，还是在微流控动态培养中追踪细胞的变化，CellTracker都显示出明显优势。当然，在实际操作过程中有许多条件需要探索、做好预实验，比如：探针浓度、标记时间以及不同颜色探针如何进行搭配等。

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参考文献：

[1]Chen J, Huang D, Wang L, et al. 3D bioprinted multiscale composite scaffolds based on gelatin methacryloyl (GelMA)/chitosan microspheres as a modular bioink for enhancing 3D neurite outgrowth and elongation. J Colloid Interface Sci. 2020;574:162-173.

[2]Liu C, Zhou Y, Sun M, et al. Light-Induced Cell Alignment and Harvest for Anisotropic Cell Sheet Technology. ACS Appl Mater Interfaces. 2017;9(42):36513-36524.

[3]Jing B, Wang ZA, Zhang C, et al. Establishment and Application of Peristaltic Human Gut-Vessel Microsystem for Studying Host-Microbial Interaction. Front Bioeng Biotechnol. 2020;8:272.