如何评价水凝胶的促成骨能力？（体外篇）
骨缺损是一种常见的临床疾病，目前多采用自体或异体骨移植的方法进行治疗。组织工程的进步为骨缺损的治疗打开了一条新的路径，旨在利用支架、细胞和因子协同促进骨的修复。水凝胶是一类独特的支架材料，可以通过分子组合和结构调控赋予多种不同的特异性功能，它还可以模拟自然的组织环境，为缺损部位提供结构支持，使骨缺损通过内在愈合机制修复。
一般来说，我们在进行动物实验之前，都会进行一系列实验来验证水凝胶材料的成骨能力，因此本期EFL为大家整理了水凝胶在体外促进成骨能力的评价方法供大家参考。
01
成骨相关细胞的检测
（1）ALP活性：碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，因此检测细胞内ALP活性是研究体外成骨能力的重要手段之一（图1A-B）；
（2）茜素红染色：同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物，茜素红可以与钙发生显色反应，生成深红色的化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色（图1C-D）。
案例一
纳米粘土-有机水凝胶骨密封剂(NOBS)用于骨愈合
图1（A-B）ALP染色及活性检测，（C-D）茜素红染色及定量
文献链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.202003717
（3）Trap染色：抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）为破骨细胞的标志酶，为破骨细胞所特有，Trap染色后的破骨细胞呈现红色（图2）。
案例二
含有二氧化锰(MnO2)包覆成纤维细胞激活蛋白抑制剂(FAPi)的磷酸钙微球的复合水凝胶用于骨质疏松性的骨缺损修复
图2 Trap染色
文献链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.202201067
02
基因、蛋白的表达
（1）q-PCR检测：可以进一步探究材料的促进细胞成骨分化能力，这是一种从基因水平评价细胞的相对mRNA含量来表示成骨分化程度的方法。主要有碱性磷酸酶(ALPL)、分泌型磷酸蛋白1(SPP1)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGLAP)和I型胶原α1链(Col1a1)的表达。通过Western blotting检测不同处理组骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白的表达（图片源于案例二）。
图3 复合水凝胶上BMSCs体外成骨的表征：C)成骨相关基因在第7天(Alpl、Spp1和Runx2)和第14天(Col1a1和Bglap)的表达。D)成骨相关蛋白在7天(OPN和Runx2)和14天(COL1和BGLAP)的表达
（2）检测破骨细胞生成相关基因：其可进一步探讨复合水凝胶对BMMS破骨细胞分化的影响，主要有Fos原癌基因(Fos)、活化T细胞核因子1(Nfatc1)、酸性磷酸酶5(Acp5)、基质金属蛋白肽酶9(Mmp9)、组织蛋白酶K(CTSK)的表达（图片源于案例二）。
图4 BMMS在复合水凝胶上破骨成骨过程中Fos、Nfatc1、Acp5和Mmp9的相关基因表达和蛋白表达的定量分析
（3）蛋白质组学及分子功能分析：水凝胶中含有与细胞迁移、粘附和血管生成功能显著相关的成分，蛋白质组学分析表明，水凝胶与“细胞外基质”呈显著正相关，而与“核成分”无关。分子功能分析表明，这些组分参与了胶原、整合素、钙离子、钙调蛋白和钙依赖蛋白的结合，有助于生物矿化并诱导细胞行为和生物矿化 。
案例三
骨膜基质衍生的水凝胶在骨愈合过程中的免疫调节和促进骨再生作用
图5 蛋白质组学及分子功能分析
文献链接：
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0142961219306519
03
血管的生成
（1）成血管化：其是组织工程骨缺损修复的关键，且在新生的骨组织形成之前构建血供系统是极其重要的一环，已被认为是继细胞、支架和因子三大要素之后的又一重要因素。常见的就是构建组织工程血管化的有关细胞和相关因子，EFL在之前分享过如何表征水凝胶的促血管生成能力，这里不再为大家详细介绍，举两个典型的例子供大家参考。
案例四
人脐静脉内皮细胞（hUVECs）实验表明该水凝胶具有促血管生成作用
图6 水凝胶的促血管生成作用（血管化细胞）
文献链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201906205
案例五
CD31（血小板-内皮细胞粘附分子）评估血管生成
图7 水凝胶的促血管生成作用（CD31）
文献链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.202008515
EFL小贴士
以上就是EFL为大家整理的三类体外评价水凝胶骨修复能力的方法，需要注意的是，大家要根据体系的设计方案和修复机制的区别，选择其中的一种或者多种组合协同证明材料的骨修复潜力即可。