如何评价水凝胶的促成骨能力？（体内篇）
水凝胶的多聚体系统为细胞的增殖分化、内源性再生、组织修复、血管再生及药物持续传递提供良好的基质，而其三维多孔结构则可模拟原始细胞外基质的微结构，为骨修复提供动态的生态条件。我们在上一期总结了水凝胶在体外成骨能力检测的相关评价方法，但通过一系列的体外实验证明水凝胶材料具有可靠的成骨性能只是完成了实验的一部分，很大程度上是在受控的人工环境下进行；而动物实验体内的成骨研究可以进一步证明设计材料的潜在应用性，因为体内才能构建机体与材料之间成骨微环境的动态系统。
对于骨重建的动态过程，监测不同时期的骨愈合状态及其相关信息是至关重要的。本期EFL为大家整理了水凝胶在体内动态骨重建过程的评价方法。
01
M1-M2巨噬细胞的转变
利用生物材料进行骨缺损的修复及再生是一个复杂且长期的过程，适宜的免疫炎症微环境及成骨性能缺一不可。在生物材料植入体内早期，巨噬细胞活化为M1表型促进炎症反应并启动组织再生。伴随着早期炎症反应的减弱，巨噬细胞由M1表型转变为M2表型以推进后续的骨修复过程。如图1所示，炎症晚期出现大量的iNOS细胞，而几乎未检测到CD206细胞，这表明巨噬细胞的 M1 向 M2 转变并不顺利（图1A，B）。当用PEM 水凝胶处理时，CD206细胞的数量和M2/M1比率增加（图1B，C）
案例一
PEM水凝胶具有促进巨噬细胞M1-M2转变的能力
图1 PEM 水凝胶具有促进巨噬细胞M1-M2转变的能力
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961219306519?via%3Dihub
02
影像学评估新生骨组织
（1）X射线：由于骨骼含有大量钙盐并具有高密度，可以与周围的软组织形成鲜明的对比。当X射线穿透不同厚度和密度的组织时，X射线会受到不同程度的吸收。因此X线平片可使骨关节清楚显影，修复程度可以从X线片中直接观察到（图2）。
案例二
超强骨传导矿化木材水凝胶用于骨骼修复
图2 水凝胶植入两个相邻骨缺损部位的X射线图像
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202010068
（2）CT（计算机体层成像）：CT图像是由一定数目由黑到白不同灰度的像素按矩阵排列所构成。这些像素反映的是相应体素的X线吸收系数。与X线图像所示的黑白影像一样，黑影表示低吸收区，即低密度区，如含气体多的肺部；白影表示高吸收区，即高密度区，如骨骼。与X射线不同的是，CT图像不仅可以用不同灰度显示其密度的高低，还可用组织对X线的吸收系数说明其密度高低的程度，具有一个量的概念。如图3所示，CT图像用于定性评估不同材料的性能，可以明显观察到新骨的形成，多组分水凝胶显示出了更高的对比度，表明其骨密度较其他组更高。
案例三
多组分纳米复合水凝胶促进骨生成
图3 复合水凝胶修复新骨区域示意图以及CBCT扫描结果
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201906205
（3）MRI（核磁共振成像）：MRI是检查骨和软组织疾病的重要手段，它以高组织分辨力及任意切面成像为特点。磁共振成像通过它多向平面成像的功能，使神经、肌腱、韧带、血管、软骨等其他影像检查所不能分辨的细微结果得以显示。由于其成像与水密切相关，更适合检测关节软骨的修复程度。当然，MRI也存在着不足之处，对于骨与软组织病变定性诊断无特异性，成像速度慢，易造成伪影。如图4所示，展示了在水凝胶中引入超顺磁性氧化铁（USPIO）用于软骨修复的效果。
案例四
含有USPIO的功能水凝胶以增强软骨再生
图4 利用MRI对新生软骨进行评估
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsami.9b12288
03
组织染色
组织染色技术是判断骨愈合程度的一个基本方法，通过细胞表面标志物和胶原等成分即可观察骨修复的过程以及修复效率。常见的染色方法如HE染色、Masson染色、Trap染色、茜素红染色等等。各种不同的染色方法可以有效区分不同的新生组织和成骨标志物，其中，HE染色和Masson染色是两种最基本的染色方式，Trap染色和茜素红染色我们在之前已经提及。相关染色手段比较多，因此为大家总结常见染色供大家参考学习（表1）。
表1 骨修复相关染色总结
友情提示：根据材料和体系的设计，选择一种或者多种染色组合对不同修复时期骨的动态进行监测，常见的组合如HE-Masson、HE-Masson-Goldner、Masson-茜素红-Trap等。
04
（1）共聚焦荧光成像：其可对骨组织的重建过程进行动态监测，从而用于进一步的组织学评估。新生骨的不同颜色代表动态的骨形成(图5) 。蓝色荧光显示第2~4周的成骨过程，绿色荧光显示第4~6周的成骨过程，红色荧光显示最后3周的成骨过程。
案例五
共聚焦荧光图像评估骨组织的动态重建
图5 共聚焦荧光成像评估新生骨组织
原文链接：
https://link.springer.com/article/10.1007/s40820-020-00547-6?utm_source=xmol&utm_medium=affiliate&utm_content=meta&utm_campaign=DDCN_1_GL01_metadata
EFL小贴士
以上就是4种常见的用于体内骨重建的评价方法。由于体内的骨重建是一个动态过程，要求我们对体系的设计和参数进行提前设计，比如材料本身的促骨机理、植入材料的降解速率、促骨促血管因子的作用时间周期以及整个修复周期的大致时间等。因此，我们要合理选择检测方法，毕竟方法没有最好的，只有最合适的~