HPLC工作原理之混合与脱气
1.概述
反相HPLC（RP-HPLC）对样品的分离，分析主要依赖于所使用的色谱柱类型，以及流动相的特点，如有机相的选择性以及洗脱强度，水相的pH，是否使用缓冲盐以及离子对试剂等。而流动相在使用之前需要经过相应处理，如混合（手动混合或在线混合），脱气以及过滤等。
2.混合
流动相手动混合（Isocratic）可避免在线混合（Gradient）流动相组成的轻微波动，导致进入检测器流通池内流动相的折光率发生变化进而对基线噪音产生影响。特别是在其中一相比例＜5%以及在做正相洗脱的时候，优先手动混合而不选择在线混合。
而在做梯度洗脱的时候，则必须使用在线混合以满足液相系统对于流动相随时间变化而变化的需求。
2.1手动混合
在使用HPLC进行等度洗脱的时候，一般预先将流动相按比例混合，而在进行梯度洗脱的时候，只能够选择在线洗脱。在手动混合流动相的时候，需要注意流动相是按照体积比进行混合，如需配制1L水-甲醇（40：60）的流动相是分别量取400mL的水以及600mL的甲醇进行混合，得到约965mL的流动相，而不是先量取400mL水（600mL甲醇）再加入甲醇（水）至1L。不同类型溶剂体积比混合之后体积变化如下图1所示。
Fig.1 Volumechange of solutions when water is mixed with different organic solvent
此外在配制具有精确pH控制的缓冲盐流动相的时候，可按照重量法分别量取缓冲盐及其共轭酸/碱或者配制等摩尔量的缓冲盐及其共轭酸/碱溶液，用共轭酸/碱溶液调节pH到预定值，一般在使用缓冲盐以及离子对作为流动相添加剂时，需要过滤除杂。
2.2在线混合
目前HPLC系统梯度洗脱模式应用最多的两种在线混合模式分别为高压在线混合以及低压在线混合，其混合示意图分别如图2A以及2B所示。
Fig.2A HPLC system configuration for high-pressure mixing
Fig.2B HPLC systemconfiguration for low-pressure mixing
如图2A所示，高压混合模式意即流动相在泵后的高压区域进行混合，这种模式需要为流动相A以及流动相B分别配置输液泵。流动相的比例混合依赖于两输液泵的相对速率。如流动相组成为水-甲醇（40：60），流速1mL/min，采用高压混合模式时，A泵（水相）体积流速为0.4mL/min，与此同时B泵（有机相）体积流速为0.6 mL/min，之后经由混合器混合流经进样器进入色谱柱。
当然这种混合模式，体积流速在经混合器混合之后发生轻微变化，实际流量要比1mL/min要小一些，约为0.965mL/min。反过来，对于化合物洗脱作用亦会减弱3.5%左右，其保留时间相应增加3.5%（不考虑其他的因素）左右，这种影响对于不同实验室，不同仪器以及新旧色谱柱之间转移时，保留时间漂移要求处在±0.1-0.2min的范围来讲，是完全可以接受的。
对于梯度洗脱模式，高压混合下，两泵的体积流速随梯度的变化而变化，如有机相按照2-95%的梯度变化，流速1mL/min，梯度开始时B泵的体积流速为0.02mL/min（A泵体积流速为0.98mL/min）直至梯度结束时B泵的体积流速为0.95mL/min（A泵体积流速为0.05mL/min）。随着梯度的运行，在A泵与B泵的体积流速变化的同时，混合器之后的流速亦会按照图1中所示变化。同样地，方法在使用同样混合模式的仪器之间转移时（不考虑不同仪器之间死体积以及滞留体积的不同），并不会对保留时间造成明显的漂移。
如图2B所示，低压混合模式意即流动相在泵前低压区域进行混合。这种混合模式比较经济，相比高压混合模式需要更少的输液泵。流动相的比例混合依赖于两路流动相流路上设置的电磁比例阀的开启时间。如流动相组成为水-甲醇（40：60），流速1mL/min，采用低压混合模式时，在任一时间内，电磁比例阀对于A路流动相开启40%时间，B路流动相开启60%时间（通常是有比较小的脉冲存在的）。混合器可与电磁比例阀串联或者将二者整合在一起，经混合器混合之后，体积依然如同高压混合模式一样减少3.5%左右。由于流动相混合发生在泵前，泵后的流速可保持1mL/min恒定不变。在其他条件不变的情况下（色谱柱，温度，流速设置等），使用低压混合模式的保留时间要比使用高压混合模式下保留时间略微减小。在使用梯度洗脱时，低压混合保持流速恒定，每一泵液周期内电磁比例阀的比例随梯度而变化。
串联二元高压输液系统如下图3所示，两个泵串联在一起组成一个串联泵单元。在工作时，流动相由于第一个柱塞杆拉出造成负压而进入腔体，与此同时出口阀处于关闭状态且第二个柱塞杆推入腔体将流动相推入泵后流路。
Fig.3 Schematic of a binary high-pressuresystem
高压混合模式具有两个泵单元且可独立控制，在低流速下具有更好的流量精度以及混合精度，特别适合于窄内径色谱柱以及UPLC系统；由于混合发生在泵后高压区域，在线脱气机可选配。低压混合模式使用更少的泵，使用成本以及维护成本会降低，电磁比例阀切换的延迟时间导致混合精度低于高压混合模式，且必须配置在线脱气机。
此外，如图2A以及2B所示，低压混合模式由于混合器之后具有更长的流路，因而其滞留体积要大于高压混合模式。在HPLC分析方法转移的时候，需要予以关注（参见前期文章“根据分析方法的目的，高效地进行液相色谱方法开发之几个基本概念”）。
2.3.混合效果评价
对于在线混合效果的评价，可采用“Step-Wise”方法进行测试。该方法，A相使用纯水，B相使用含有0.1%丙酮的水溶液，检测器波长设置为丙酮的特征吸收波长265nm，流速设置为1mL/min，色谱柱以毛细管替换。
Step-Wise程序可按照下述进行，B相从0%-40%，Step Size设置为10%；40%-60，Step Size设置为5%，60%-100%，Step Size设置为10%；Step Dwell设置为4min使得每一Step在设置的时间内达到稳定（如图5A所示）。另B相从45%-55%，Step Size为1%，Step Dwell时间为4min（如图5B所示）。接受标准可按照Step-Sise=5%±0.05%，Step Dwell的起止点Apparent Response= AbsoluteResponse±Absolute Response×1%。
Fig.5A Results of mobile phase proportioningStep-Wise
Fig.5B Results of mobile phase proportioningStep-Wise
如图5A所示，Step Dwell起止点平坦，Step-Sise误差在0.05%以内；图5B显示在50%到51%转换的时候，Step-Sise偏离1%比较多。
图6（另一泵系统）所示，40%与45%处比实际值少了1.8%，50%处比实际值高了1.6，55%处比实际值高了1.7%，40%处出现了脉动，45%-50%转换的时候，出现了扰动，实际Step-Sise为8.4%。
一般地，Step-Sise精确度变差，一般是由于电磁比例阀的控制不准；Step Translation以及Step Dwell的扰动一般是出现气泡或者单向阀故障。
Fig.6 Results of a failed mobile phaseproportioning Step-Wise
同样地，该方法也可用于测试梯度变化的线性是否良好，梯度变化为B相从0%，在一定时间内变化到100%（如15-30min），如图7所示，在25%，50%以及75%处出现了非线性扰动点。
Fig.7 Results of gradient linearity test withsome distortions
3.脱气
空气在单一有机相或者纯水中的溶解度要大于在二元或三元混合溶剂中的溶解度，开瓶有机相与纯水混合时，溶解在其中的空气有饱和状态变为过饱和状态，这时含有过饱和空气的流动相在流经流路的转角时，空气就可能从混合溶剂中游离出来。
在高压混合模式下，两相在泵后高压区域混合，溶解在流动相中的空气由于高压的作用会留在流动相中；对于低压混合模式，由于混合发生在泵前的低压区域，过饱和的空气会从流动相中游离出来进入泵的腔体内，引起压力以及流速不稳。
此外，无论是高压混合还是低压混合，流动相在混合之后进入色谱柱内高压区域，之后均会进入柱后低压区域。流动相中的空气，由于压力突然减小而游离出来进入检测器流通池内，造成基线噪音变大。在流动相使用前进行超声脱气，在分析方法运行过程中使用在线脱气机脱气，可最大程度地除去流动相内的空气。在线脱气机示意图如下图4A及4B所示。
Fig.4A Schematic of an on-line degasser system
Fig.4B Principle of an on-line degasser system
在线脱气机主要由真空泵以及螺旋管状的允许空气透过的膜组成。当流动相进入管路腔体内时，腔体外处于真空负压状态，空气由流动相游离并透过管路进入真空室，实现脱气功能。需要注意的是，在线脱气机并不能够实现100%的脱气效果。
4.结论
使用HPLC等度洗脱的时候，一般预先将流动相按比例手动混合，减少使用在线混合精度对于基线噪音的影响；使用梯度洗脱的时候，流动相的混合有高压混合以及低压混合两种模式，每种模式均有一定的缺点。无论哪种洗脱模式，均需要对流动相进行脱气处理，此外，对HPLC的输液单元进行流动相混合效果评价也应成为预防性维护的组成部分。
Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
作者公众号：Pharma_Analytical
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