反相液相色谱鬼峰来源
1. 概述
在反相液相色谱分析方法开发过程中，采用等度洗脱时，先洗脱组分的色谱峰峰宽较窄，后洗脱组分的色谱峰峰宽较宽；而梯度洗脱方式，则具有分析时间短(特别是对于样品组分复杂的情况来说)，在梯度范围内各色谱峰的峰宽近乎一致等特点。梯度洗脱时色谱峰纵向扩展可控特点，可参考下图1进行理解。
基质或者样品组分比较复杂时，梯度洗脱是反相液相色谱最常用的操作模式，而主要在梯度洗脱中出现的鬼峰是特别让人头疼的。有可能由于来源排查不清以及解决方案不到位而导致原来的方法在实际的应用与转移过程中出现问题，甚至面临重新开发方法的尴尬境地。鬼峰意即来源不清，不可指认，时有时无，对目标峰或者样品纯度测试产生干扰作用的峰，如下图2所示，即为典型的鬼峰，一般来讲，鬼峰的出现与色谱柱无关(当然，梯度洗脱时，梯度设置不合适的情况除外)。
对于含量或者纯度检测方法而言，在主峰位置或附近出现鬼峰的话，影响到方法的专属性以及检测结果准确性(如下图3)。特别地，对于药物制剂或者API的纯度测试来说，要求对降解产生的杂质之外的杂质来源做出较详细的说明(如反应副产物或者反应原料带入等)。鬼峰的出现，可能增加此项工作的难度与工作量。
此外，鬼峰需要与梯度洗脱时由于梯度的突然变化引起的梯度峰进行区分，如下图4所示，在20 min处由于梯度的陡然变化，造成流动相组成的急剧改变引起流动相折光特性发生很大的变化，而出现梯度峰(其峰形与所定的检测波长有关)。
在梯度洗脱模式下，可以通过避免突然大范围改变流动相的组成来避免尖锐的梯度峰的出现，同时也有助于减少泵的故障率。
2. 鬼峰来源与解决方案
鬼峰来源多种多样，理论上讲，在HPLC系统中任何一个节点均有可能引入鬼峰，依据鬼峰出现的频率，其主要来源于流动相部分，样品制备以及自动进样部分，仪器流路及检测器部分等，如下图5所示。
2.1 仪器流路及检测器引起的鬼峰
仪器流路中的残留气泡可以引起鬼峰，保留时间一般不可重现，即使流路中气泡连续存在，鬼峰出现的位置亦不可预测。可将流动相超声或鼓He脱除气泡并打开purge阀，大流速冲出仪器管路中的气泡，来减少气泡引起的鬼峰现象。
由泵的混合或者泵的突然切换引入的鬼峰一般发生在梯度峰及其之后位置，在低压混合模式下出现的可能性更大。实际应用中(无论是高压混合模式还是低压混合模式)，梯度峰之后经常是不被关注的地方，如下图6。同一台仪器，可通过进样Blank或检查紫外吸收光谱，确认其是否为鬼峰。在不影响分析方法目的以及对结果判断的情况下，可不用对此过于纠结。
检测器处引入的鬼峰，多为一些样品组分在检测器流通池内的残留，其特点具有先后针之间的重复性差，或者没有重复性，色谱峰峰形特别尖锐类似大的毛刺。该种情形下，需要对流通池特别是石英视窗进行彻底清洗(联系工程师或者严格按照manual进行)。
混合器本身有时也会引入鬼峰，如下图所示同样的流动相，在系统流路的不同位置(分别为混合器前面与后面)添加污染物捕集装置，对基线进行监测如下图7所示。从图中可以明确看出混合器由于被污染而在色谱图上引入了鬼峰。
此外，同一台仪器经常在不同的流动相体系之间进行切换的时候，特别需要注意整个仪器管路内的污染物残留。当怀疑仪器流路内壁被残留物污染时，可用水：乙腈：异丙醇：甲醇=1：1：1：1的比例，以1mL/min的流速冲洗整个流路2h以上，可将流路内的污染物残留冲洗完全。
2.2 样品制备以及自动进样引入的鬼峰
由样品制备引入的鬼峰，多集中与使用了不干净被污染的溶剂或者不干净的进样小瓶(如下图8)。
这种情况下的鬼峰，容易排除，仅需要分别将样品溶解或稀释用的试剂以及进样小瓶更换，即可确定鬼峰的来源。
此外，由自动进样器引入的鬼峰，也不在少数。自动进样器进样的流程(如下图9)所示。在进样之后，部分样品溶液残留在进样针头以及针座之上，对下次进样别的样品的结果产生干扰，出现鬼峰。对于一些强吸附性组分，尽管进行程序洗针，有时依然可能会引入鬼峰。
针对这种情形，可在仪器平衡之后，分别进样不同试剂的Blank以及不进样，比较得到的图谱，基本可确定鬼峰是否来源于进样过程。
2.3 流动相引入的鬼峰
在实际的应用中，鬼峰最主要来源为流动相，包括水相，有机相，有机酸碱添加剂，缓冲盐以及流动相瓶等，(如下图10)所示。
其中水相引入的鬼峰是最常见的，水中含有的有机，无机杂质均有可能对检测结果产生干扰，出现鬼峰。水相引入鬼峰的可能原因有：水中本来含有的有机，无机杂质；水相在使用过程中有尘埃或者空气中的有机物落入或溶解进去；水相在存放或使用的过程中，细菌等微生物滋生等。
有机相如甲醇，乙腈，四氢呋喃等，亦有可能引入鬼峰(如上图10所示)。有机相引入的鬼峰，原因多为有机相使用完之后未更换新的流动相瓶，而是直接添加补充的方式；以及流动相长期使用过程中从实验环境中富集来的污染物。
在实际操作中，可以采用下述方法判断鬼峰来自水相还是有机相。当怀疑鬼峰来自水相的时候，以低比例有机相的流动相(5%或以下的有机相)平衡色谱柱15以及30min，之后以一定的梯度进行洗脱，若发现色谱图中累积的鬼峰与色谱柱平衡时间直接相关(如下图11A所示)，基本可判断鬼峰来源与水相。如果鬼峰的累积量与平衡时间长短之间无直接相关关系，则鬼峰来源与有机相(如下图11B所示)。
在使用有机酸碱添加剂以及缓冲盐的时候，鬼峰则可能是由于添加剂以及缓冲盐引入的(如下图12)，因此在实际使用时，需要使用HPLC级别的添加剂以及缓冲盐，并在条件允许的情况下，对比不同厂家选择最好的。
此外，流动相瓶也是鬼峰来源之一，对于新的流动相瓶在使用之前，需要进行彻底清洗，如先用热的自来水冲洗10遍之后用去离子水冲洗10遍，在清洗过程中不可使用洗涤剂。
2.4 其他引入的鬼峰
一般地，色谱柱本身不会引入鬼峰，但色谱柱可对流动相或系统流路内的强保留污染组分起到富集作用，在有机相比例随梯度程序变化的过程中而被冲洗出来。这一点，在使用较长的色谱柱的时候尤其值得关注，因为色谱柱本身较长，在HPLC上其允许的操作流速较小，需要的平衡时间较长。以低比例有机相作为起始流动相进行色谱柱平衡的时候，水相中的强保留污染物被色谱柱富集，之后在梯度运行的时候被洗脱出来，这种鬼峰的出峰位置一定，大小一定。也因此，在水相不确定是否有杂质存在的条件下，梯度运行后的再平衡时间尽可能的短，一般以10倍柱体积为宜。
2.5 如何应对鬼峰
从上面的讨论，鬼峰的来源多种多样，基本应对原则就是，找到鬼峰的来源，更换流动相或更换添加剂或对仪器被污染部分进行清洗。此外，由于大部分的鬼峰来源与流动相以及色谱柱之前部分流路，在液相色谱流路中添加杂质捕集装置，可消除大部分的鬼峰干扰。而捕集装置的安装位置有多处，(如下图13)所示。
捕集装置的安装位置不同，消除鬼峰干扰的效果也不同，如上图中e处位置的捕集效果要好于d处，但若混合器是干净的，两处的效果则是等效的。在泵后使用杂质捕集装置，系统压力会随着污染物在捕集装置上的积累而逐渐增加，因此需要定期更换。
而对于使用有机酸碱添加剂或者缓冲盐流动相的含量或放行分析方法，也可以通过改变梯度程序，将鬼峰与主峰的出峰位置最大程度地拉开，避免鬼峰对于样品组分含量测定结果的影响。
3. 结论
鬼峰对于反相液相色谱来说，是经常遇到的问题，对分析方法造成干扰并影响分析结果的准确性。尽管其来源多种多样，但可根据鬼峰的特点，追溯其来源并针对来源进行相应地处理(如更换流动相，清洗流路，冲洗色谱柱等)。在排除仪器本身的原因之外，鬼峰主要来源于流动相特别是水相以及添加了添加剂或缓冲盐的水相，在液相色谱流路中添加杂质捕集装置，可以最大可能的减少鬼峰的出现，但需要定期更换该装置。
Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
作者公众号：Pharma_Analytical
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