一个新型BTK抑制剂的发现过程

上个星期听到了Genentech公司的Dr. Wendy B. Young介绍了她们团队的工作，突然很想查阅一些相关的资料，尤其是了解临床前和临床阶段的数据分析、体内体外的PK、LO、直到将化合物推到Drug Candidate，进入临床试验的系列过程。稍作总结，还请各位同仁不吝指正。

BTK的发现历程

早在1952年Dr. Ogden Bruton首次描述了X染色体连锁的丙种球蛋白缺乏血症(X-linked agammaglobulinemia，XLA)，这类病人无法产生成熟的B细胞，免疫系统不健全，无法应对自然界中轻易的病菌感染。(强调一下：这是一项开拓性的工作，首例免疫缺陷的病症)

这类X染色体上基因缺陷诱发的可遗传疾病发病率并不是很高，男孩携带缺陷多为患者，而女孩多为携带者，但她的儿子有一半的发病率。有数据显示两百万人中有1位新生儿患者，而一百万人中有一位男孩会遗传此病，而30%~50%的患者有一定的家族遗传病史，其余的则多为基因自发突变引起。

人们已获得与之相关的小鼠模型Xid (X-linked Immunodeficiency)用于研究疾病的发病机理，这类小鼠的疾病进程要比XLA的缓慢，值得一提的是这类小鼠很少患狼疮(一种会影响多种器官的自体免疫疾病)和胶原性关节炎(Collagen Induced Arthritis)。

直到1993年人们发现Bruton's tyrosine kinase (BTK)之后渐渐地解开了XLA的发病机理。BTK是Src相关的BTK/Tec家族中一种非受体类、细胞质中的酪氨酸蛋白激酶，在B细胞成熟和激活过程中有着重要的作用，在B细胞恶性肿瘤细胞内高表达。

现在人们已经知道BTK的PH结构域(Pleckstrin Homology Domain)与PIP3结合后可磷酸化磷脂酶C(Phospholipase C)，活化的磷脂酶C将PIP2水解成两个关键的信使分子：肌醇三磷酸(Inositol Triphosphate, IP3)和甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)，会引发下游许多和B细胞信号转导相关的分子，直接影响B细胞的成熟、活化、信号转导、增殖和生存等过程。

B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-cell Chronic Lymphocytic Leukemia, B-CLL, 也被称为 Chronic Lymphoid Leukemia, CLL)是白血病中最常见的一种类型，是B细胞增殖异常诱发的一种疾病，在血液和骨髓中大量的B细胞耗去了绝大部分的养分，影响正常血细胞的功能。

目前上市的BTK抑制剂有Ibrutinib (也叫PCI-32765，依鲁替尼，Imbruvica®，简称IB)，一个选择性的BTK抑制剂，用于治疗CLL和套细胞淋巴瘤(Mantle Cell Lymphoma, MCL)。

进入临床的有：Phase 3的Acalabrutinib，用于治疗复发性CLL，整体效果约有 95%的缓解，是Acerta Pharma研制的“第二代”BTK抑制剂，具有比IB更高的选择性(更低的副作用)，目前约有24个与之相关的临床试验在进行。

Phase 1的ONO-4059(又称GS-4059)，关于非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)及CLL( NCT02457598)；Spebrutinib (AVL-292,CC-292)和BGB-3111 for CLL等等。

Ibrutinib让BTK获得关注

2012年的美国血液学会会议(American Society of Hematology meeting)中报道了PCI-32765(也就是后来上市的IB)对多种B细胞淋巴瘤积极的治疗效果，当时对于这个化合物的市值交易评估在9.75亿美元。[1] 当时人们已经知道BTK参与B细胞信号转导过程，逻辑上讲可以作为B细胞内的靶点，也是在这个化合物的临床结果出来之后，人们看到了BTK作为一个热门的靶点在B细胞淋巴瘤治疗中的重要性，也让一些玩家手痒痒，很想参与这份角逐，其中就包括Genentech。

BTK是治疗CLL的一个非常具有吸引力的靶点，First-in-class的药物IB是一种靶向BTK的选择性、可逆制剂(Irreversible BTK inhibitor, TKi)，可以阻止CLL中许多重要的生存信号通路。尽管如此，BTK 结合位点发生突变后依然伴随抗药性的肿瘤细胞产生。 此外，IB同时还可以抑制ITK，限制抗体介导的细胞毒性(Antibody Dependent Cytotoxicity, ADCC)，有一定的毒副作用。临床数据显示停药后有些患者易发生进行性疾病(Progressive Disease, PD)，比如Richter综合征(Richter Syndrom, RS)或CLL，这类病人的细胞多有发生17p染色体缺失，或复杂的细胞核型等现象，他们的总体生存率(Overall Survival, OS)较低，约为3.1个月。分子生物学结果揭示患者停用IB后细胞发生的变化，同时也报道了细胞内BTK-C481S基因突变对IB的耐药性机理，这类不良事件( Adverse Events, AEs)也提示人们治愈CLL的路还很漫长，需要有更进一步的突破。[2]

新型的BTK抑制剂GDC-0853的发现历程

Genentech的一个近期的研究结果提供了一个新型的BTKi：GDC-0853。它不依赖BTK的C481位点，拥有更高的BTK选择性，并且不干扰ITK的活性，毒副作用更低。

本文想尝试描述Genentech公司的一个临床试验化合物—GDC-0853的发现历程，一个高选择性、非共价结合、可口服的BTK抑制剂，通过抑制B细胞的活化及BTK介导的下游生存信号通路，进而抑制高表达BTK的恶性肿瘤B细胞的增殖。

早期的化合物CGI-1746(起初由CGI Pharmaceuticals研制，后来被Gilead收购)是一个高效的、高度选择性的、非公价结合、可逆的BTK抑制剂，是研究BTK信号通路时非常有用的一个小分子抑制剂，可用于分析类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)和其他B细胞或免疫系统混乱引起的疾病，这个化合物在动物体内对治疗RA很有效，可是它的ADME性能不好，不适合作为候选药物(Drug Candidate)，在大鼠体内的清除率为87 mL/min/kg，口服生物利用度(F)<5%。可是它与BTK的相互作用给了一些人提示：可以作为一个Lead继续优化 H3 Pocket位置，让化合物和BTK结合的更为默契，于是就有了GDC-0834。[3] (本人化学基础几乎为零，亟需请教一下公司的化学牛人)

据文中描述，化合物和蛋白的共结晶结构表明化合物结合BTK后改变了BTK本身的构象，由于丁基(t-butyl)和苯基(phenyl)的亲脂性让Y551移动了18Å的距离，诱发一种Src-like的失活构象变换，进而抑制BTK的活性。但图中不难发现，化合物的右侧与Y551还有一段距离，缩短这个距离(延伸化合物长度或者改变右侧的亲和力)是否会有帮助？

通过SAR分析，先一步步改变CGI-1746右侧的结构，先后测试分析了约有100个衍生物对BTK的抑制能力以及通路下游细胞表面的CD86分子的表达。根据亲脂结构的限制，只有少数化合物表现了对靶点的抑制。结果显示若是去除右侧的丁基，化合物的抑制功能下降(IC50=4.6 uM)；相反，若是补加上对位取代基，IC50有了明显下降(<0.5 uM)，可是测试的化合物均不如1746本身更为有效，或许由于丁基的结构更适合于亲脂的结构域结合。

考虑到她的生物利用度较低，下一步可以由此下手，设法提升化合物的生物活性。于是人们尝试更改苯基的极性(试图降低亲脂性，降低 LogD，延长在体内停留的时间吧)，如此一来所有测试的化合物对BTK的抑制能力下降，除了一个化合表现出与CGI-1746同样的亲和力—也就是CGI-0834右端的结构，最安慰人的地方在于这个化合物在大鼠体内的生物利用度提高了(CL=6.0 mL/min/kg, F=29%)。在药物化学家的眼里，噻吩(Thiophene)在生物体内并非是一个稳定的结构，易于被代谢而生成有活性的物质。不过这个化合物中噻吩的右侧要有一部分位阻结构，左侧有酰基吸引电子，被代谢的问题减轻了许多。到此，人们停止了对CGI-1746右侧的结构的优化，希望修改其他部分来提升化合物的活性。[3]

人们从H2 pocket入手，设计了超过300个化合物，看到没有取代的芳香烃结构(unsubstituted mono aryl groups)丧失了对BTK的抑制能力，二环类似物(bicyclic analogs)的性能也不如CGI-1746，其中发现两个结构的IC50值可以接受，经体内实验评价后选择生物利用度较高的化合物，也就是CGI-0834 (IC50=0.006 uM, CL=4.4 mL/min/kg, F=35%)。接下来就是在其他水平、靶点分析这个化合物的综合性能，比如细胞试验中对CD86表达的影响、对IgE抗体刺激的CD63分子的影响、对IgD抗体刺激的CD69分子的影响，在大鼠某种疾病模型中的效果等等，这个化合物都表现出很好的活性。尤其是在酶学层次的选择性与1746一样高(分析331个激酶)、对细胞受体几乎没有off-target的影响、对hERG通道的影响较低(在10uM时的抑制有27%)、对在Ames和Micronucleus试验中基因毒性为阴性。此外，CGI-0834与BTK的共结晶结构揭示了她们之间的相互作用于CGI-1746非常匹配。

为了快速分析CGI-0384在临床上的表现，人们选择了一种剂量在临床上初步进行了测试，观察到的结果显示CGI-0384内部的酰胺键容易断裂，导致在体内代谢过快，这使得这个化合物不适合开展后期的低剂量的临床试验。后续的机制研究发现该处的断裂并非依赖CYP的代谢，这个现象在人类更为显著，在小鼠、大鼠、狗和猴子体内均未发现类似的现象(那天报告中好像提到一种老鼠模型与其他鼠的数据不同，却与人的临床数据一致，若是在早日用这只“异类”的老鼠测试，或许 CGI-0384 的代谢问题不会在进入临床之后才被发现)。当然，首先就要想办法用一种更为稳定的结构替换该处的酰胺键，一篇文章报道称哒嗪酮(pyridazinone)的衍生物会提升化合物的代谢稳定性，在此就不多说了，有兴趣的朋友自己查看吧。[4]

不知用了多久，Genentech的团队发现了另一个非常potent的化合物，就是今年七月的ASCO的年会中所展示的关于BTK抑制剂的最新结果，人们在体外的试验中监测了该化合物对早期CLL样品中B细胞的扩增、CD86分子的表达、细胞的迁移以及NK细胞ADCC的作用。结果显示GDC-0853可明显降低BTK的活性，并且抑制其下游分子PLCg2，AKT，and ERK以及αIgM的活化，降低CLL细胞的活性，还可以抑制CpG诱导表达CD86分子。与IB相比，在体外转染试验中GDC-0853可以同时抑制野生型和C481S突变型的活性，此外，与抗体联用的过程中GDC-0853也具有一定的优势，与αCD20抗体联用后依然保持NK细胞的ADCC作用，相比而言IB与Rituximab, Ofatumumab或Obinutuzumab联用时会明显降低NK细胞的ADCC作用。[5] 

这些数据都显示了GDC-0853的广阔的应用前景，单独效用可比IB，并且可以用于抑制对IB产生抗药性的CLL，与单抗药物联用的效果也会更明显。上个星期的临床试验结果表明GDC-0853的安全性能较好。[6] (可惜，没有办法获得ASCO，2016的数据，看不到清晰的图片)

纵观GDC-0853的研究，这里有很多tricky的事件，有很多意外的发现，有太多失望与峰回路转，自2011年开始投入这个项目，Genentech与其他团队一同将这个化合物推向临床，看到那次seminar的致谢名单我才意识到一个化合物的背后有多么强大的研发团队。其实不必太在乎研制的化合物是Me-too还是Me-better，是first-in-class还是best-in-class，每一个过程都充满着合作、激情，每一个milestone的背后都会有许多创新。

看到有的文章说中国的药物创新性研发落后，一个主要原因是没有广大的化合物库，也有的说国内的研究过于跟风，没有用于创新的勇气，也有人说没有强有力的合作平台，我想这些问题都会渐渐地不再是问题，如今可以看到很多关于医药研发的消息、新闻、报道，看到中国利用十几年的时间约定新药申报的资料由几页变成几百页，就知道我们在起步，我们在飞快的追赶，当我们有一定的积累，发生质变只是时间的问题。

对于医药行业，我想每个人都很有信心，别的不说，国内众多的患者需要新药，太多的老年疾病需要得到治疗，这就是市场，这就是动力。真心希望国内有越来越多类似GDC-0853这样的故事，走向世界。

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TJ 

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