肥胖基因相关蛋白FTO抑制剂的研究进展
缩略词
FTO: fat mass and obesity associated
2OG:2-氧戊二酸
MA: 甲氯芬那酸
1. 肥胖症背景、药物及市场
根据WHO统计，世界范围内的肥胖率相比1980年已经翻倍，成年人中有19亿体重超重，其中6亿属于肥胖，分别占成年人口的39%和13%，另外5岁以下儿童的肥胖人数也高达4200万。肥胖不仅是一个美学问题，更和一些严重疾病相关，如Ⅱ型糖尿病、心血管疾病和某些癌症，统计显示肥胖人士相比体重正常人士更容易得这些疾病。而根据NIH的调查，肥胖一般是由多因素引起的代谢失衡或紊乱导致，主要原因有：家族遗传因素、不良生活习惯、身体机能失调，除了这些因素外，相关的基因可以在特定条件下调控饮食和代谢造成肥胖，当然这个比例在不同的种族中差别也很大，至今人类基因组上大约41个基因位点被鉴定出来与肥胖相关，其中很多基因表达的蛋白在中枢神经系统中高表达，如TMEM18, KCTD15, GNPDA2,SH2B1, MTCH2和NEGR1，而FTO和MC4R也有类似的特性。
截止至15年12月，经FDA批准在美国上市的减肥药物共6种(表1)，需要指出的是上述药物都不是直接作用于肥胖基因编码的蛋白。
药物本身也可能带来副作用，FDA六七十年代批准上市的芬氟拉明和芬特明可能会引起心肺机能障碍，而赛诺菲公司在欧洲上市的利莫那班会导致部分服用者抑郁甚至自杀，上述药物均已下架退市。
根据GlobalData的研究数据,全球减肥药市场预计将从2012年的4亿多美元增长到2022年的84亿美元，目前来看，这个市场还有很大的空间。
2. 新的肥胖基因Fto
2.1 Fto基因的发现
2007年英国科学家在和Ⅱ型糖尿病相关的单核苷酸多态性(SNP)研究中发现了和肥胖相关的基因Fto (fat mass and obesity associated)，Fto基因的变异增加了肥胖的概率。根据统计，Fto基因发生微小变异十分普遍，大约16%的成年人存在变异，平均体重比非变异者超重3kg；其中Fto等位基因的两个副本均变异，其肥胖率会比无变异的人高70%，而如果只有一个副本变异，则肥胖率高出30%。该现象在7-14岁儿童中同样存在。此外据统计欧洲白人只有35％携带两个正常的基因拷贝。
2.2 Fto基因编码去甲基化酶
Fto基因编码的蛋白属于AlkB家族，是一种依赖于Fe2+和2-氧戊二酸(2OG)的加氧酶，催化核苷酸的去甲基化(Gerken, Girard et al. 2007)。体外实验证明FTO蛋白对单链DNA上3-甲基胸腺嘧啶(3-mT)和单链RNA上的3-甲基尿嘧啶(3-mU)有着明显的底物偏好性。FTO是哺乳动物中被发现的第9个AlkB家族蛋白，这种蛋白很多在DNA修复中发挥作用，其去甲基化酶活性是生长发育必须的，有研究发现该蛋白上的一个氨基酸的定点突变R316Q抑制了FTO的核苷酸去甲基化酶活性，会导致严重生长迟缓和多发畸形。
2.3 Fto基因敲除和过表达均导致异常
2009年德国科学家发现Fto基因被敲除的老鼠(Fto-/-)，和基因正常的老鼠相比，出生后2周内生长较慢，脂肪组织和瘦肉组织较少；出生6周之内体重比其它同类轻30％至40％。这些老鼠血液中瘦素(Leptin)浓度偏低，而脂联素(ADPN)浓度较高，因此虽然吃得很多，不爱活动，却很瘦。由于可以认定Fto基因抑制新陈代谢和能量转化成热量释放，其活性被抑制后摄入能量增加，不需运动也会消耗很快。
同时牛津大学的研究人员确定了Fto基因本身过度活跃会导致肥胖。与正常小鼠相比，Fto基因过表达的小鼠食欲更强，更易饮食过量，体型也更肥硕。同样Fto基因过表达的小鼠血液中瘦素Leptin浓度降低，导致摄入增加，从而引起脂肪增加和肥胖。
另外Fto基因导致肥胖也存在性别差异，两个Fto基因拷贝均过表达的雌性小鼠即使食谱与其它正常雌性小鼠相同，其在20周后的体重也比后者重22%，但雄性小鼠的体重差异只有10%左右。
人体内Fto基因上存在的SNP极有可能通过增强Fto基因表达或是增加FTO蛋白活性的途径引起肥胖，因此抑制FTO的活性成为研制相关减肥药物提供了新思路。
2.4 FTO抑制剂研发的结构基础
FTO蛋白和底物3-mT的晶体结构中，蛋白的N端具有明显的依赖Fe2+和2OG的加氧酶活性，其R96与3-mT的O2形成的氢键、Glu234主链的氨基N原子和3-mT的O4形成的氢键，这些是FTO蛋白特异性识别3-甲基化修饰的U和T的主要结构基础。这个复合物的结构也为设计通过干扰FTO的酶活性的小分子抑制剂提供了基础。
2012年中国科学家发现除了3-mT和3-mU外，FTO能够催化6-甲基氨基腺嘌呤(m6A)的去甲基化，由于m6A普遍存在于mRNA中，因此有理由相信FTO通过影响mRNA加工来发挥功能，而这也为研发抑制FTO活性的药物提供新的思路。
3. 抑制FTO活性的小分子研究
3.1 通用2OG加氧酶抑制剂
2OG加氧酶家族具有相似的蛋白折叠方式和保守的辅助因子及底物结合位点，因此抑制剂多数作为2OG的非活性类似物，通过更强的2OG加氧酶的结合能力或阻断2OG的结合，从而发挥抑制作用，目前主要有N-乙二酰氨基酸类抑制剂、吡啶-羧酸类抑制剂和羟肟酸类抑制剂等。
3.2 FTO抑制剂的发现
由于FTO也是一类保守的2OG加氧酶，因此通用抑制剂NOG也能抑制FTO的活性。进一步基于结构的药物分子设计被用于筛选适用于抑制FTO的小分子。
而通过基于结构的药物发现并结合高通量筛选的方法，世界上有多个研究组发现了多个FTO的有效抑制剂。
①大黄酸
2012年上海药物所的研究人员筛选出大黄酸等3个化合物能抑制FTO的活性，其中大黄酸的抑制效果最好，更适合作为候选药物分子。
在大黄酸存在的情况下FTO的去甲基化酶活性并未因Fe2+浓度加倍而恢复，表明大黄酸并没有去螯合金属离子。而分子模拟表明大黄酸带正电的部分指向FTO的D233附近，而羧基指向R316附近，形成多个静电作用和氢键，体外实验中突变该位点会导致结合能力大大下降，可以推断大黄酸是通过和2OG竞争活性位点发挥抑制作用。而体内实验证明大黄酸可以很好的抑制FTO对RNA中m6A的去甲基化作用，但没有细胞毒性。
大黄酸在中药中属于芦荟和大黄的主要成分之一，临床用于治疗骨关节炎、糖尿病肾病等，同时具有协同抗肿瘤的作用。
②2OG类似物
2013年英国科学家用2OG加氧酶通用抑制剂即2OG类似物进行了筛选，在FTO和这些化合物的晶体结构中发现这类抑制剂通过金属离子螯合基团与2OG竞争
研究还发现脯氨酰羟化酶抑制剂FG-2216/IOX3和FG4592/SellbeckBio均能有效抑制FTO，不过这类抑制剂在开发药物时候需避免抑制其他2OG加氧酶，提高特异性。
③意外的发现
2014年美国科学家在研究抗癫痫药物时意外发现所得到的化学物不能有效抑制靶点蛋白PHD2，却能有效抑制其2OG加氧酶家族的FTO，而且IC50值和广谱性2OG酶抑制剂NOG接近，强于之前报道的大黄酸。
Fto基因的一个常见变异rs9939609可能与中枢神经系统疾病有关，如脑容量下降、酒精依赖等，这些病变可能与FTO的活性增强有关。这项研究中发现，用这类化合物处理细胞可以调控miRNA的表达。FTO及其特异性底物m6A也在脑组织中大量分布；而miRNA的作用位点靠近富集m6A的3’-非翻译区(3’-UTR)，因此FTO抑制剂极有可能通过保持m6A的甲基化水平来调控miRNA，这表明除了减肥药外FTO抑制剂还可能被研发神经类疾病药物。
④甲氯芬那酸(MA)——首个特异性的抑制剂
除了FTO，ALKBH5是另一个确认的m6A去甲基化酶，二者氧化去甲基化的分子机制和化学过程均相同。由于其结构的高度保守性，抑制剂的特异性是研发相关药物的挑战。
2014年底，上海药物所在前期大黄酸抑制FTO去甲基化合作研究的基础上，基于FTO、ALKBH5分别与DNA相互作用方式上的差别设计高通量策略筛选目标设计的老药分子库，发现甲氯芬那酸可以有效地抑制FTO去甲基化单链核酸上的m6A甲基化修饰，而不影响ALKBH5的去甲基化酶活。
FTO/MA复合物的晶体结构清晰地展现了FTO中β3i和β4i形成了一个特异性识别MA的疏水口袋，而ALKBH5缺乏相应的结构，这也解释了甲氯芬那酸选择性抑制FTO去甲基化的分子机制。
细胞实验表明，MA能够以浓度依赖方式提高细胞内mRNA中m6A修饰水平，并且该表型与FTO的胞内表达水平和活性密切相关，而与ALKBH5没有直接的相关性，预示MA在细胞内选择性抑制FTO的去甲基化功能，而不干扰ALKBH5或者是其它RNA去甲基化酶的功能。该研究为开发特异性的FTO抑制剂提供了化学基础。
⑤12号抑制剂——新型特异性抑制剂
2014年，新加坡国立大学的研究人员发现了几个新型有效的FTO抑制剂，最强的是第12号：4-[N'-(4-Benzyl-pyridine-3-carbonyl)-hydrazino]-4-oxo-but-2-enoicacid。
FTO去甲基化酶的活性在化合物12存在的情况下并未因Fe2+浓度加倍而恢复，而在FTO和12的复合物结构中，12的羧基氧与R316存在静电作用，同时和Y295和S318存在氢键。另一端嘧啶环上的N原子和D234的酰胺N形成稳定的氢键，这个位点十分关键，由于其他ALKB蛋白如ALKBH5中在D234位置缺乏相应的氨基酸，12也不能有效抑制抑制这些蛋白的活性，表明12是通过特异性占据活性中心的方式抑制FTO活性。
同时细胞实验表明12的乙酰化衍生物25(胞内可以水解成12)也可以有效的抑制细胞内m6A去甲基化，因此12、25和甲氯芬那酸/MA一样都是可以特异性抑制FTO活性而不影响ALKBH5，都是进行药物开发的理想分子。
4. 研发进展介绍
从上文可以看出，理想的FTO抑制剂除了要抑制其本身的去甲基化活性外，还不能影响AlkB家族其他蛋白尤其是ALKBH5的活性，由于该类抑制剂基本处在临床前研究阶段，现根据专利申请情况总结如下:
4.1 瑞璞鑫(苏州)生物有限公司
根据Biobay网站信息，瑞璞鑫生物于2014年5月成立，作为北京生命科学研究所(NIBS)在苏州的首个产业化项目，核心团队由王晓东院士领衔，NIBS常务副所长智刚以及高级研究员黄牛共同组成。目前主要开发抑制FTO活性的减肥新药，该药物是目前世界上唯一有明确生物靶点的小分子化学合成药物，属于老药新用途。根据目前的研究数据显示，该药安全性和临床治疗效果均较好，有望成为减肥药市场的重磅炸弹产品。计划三年之内能够完成第一代FTO抑制剂国内新药申报批准，和海外知识产权的转让，在世界范围研发和推广该药物。
黄牛等人采用通用的基于结构的虚拟筛选以及一系列体内外生物活性实验，发现之前被FDA批准上市的恩他卡朋(entacapone)可以作为一个FTO的特异性抑制剂，得到一个已经获得美国专利，专利号US 2014/0148383。
4.2 上海药物所
上海药物所的杨财广研究员在国际上首先发现大黄酸是FTO的有效抑制剂，随后又发现甲氯芬那酸能够特异抑制FTO而对ALKBH5等其他去甲基化酶没有影响，并以此为基础申请中国专利CN104069092A。
上海药物所曾和多家国内外制药公司合作开发药物，在成果转化方面有着丰富的经验和先天的优势。
4.3 新加坡国立大学
Esther Woon博士领导的研究组也发现化合物12及其乙酰化形式是一类特异的FTO抑制分子，并正在申请美国专利US 1409405.6，正在等待审批。
首先看三个化合物抑制FTO的IC50值，三者均高于广谱性抑制剂NOG (36.6μM)。而且从IC50看三者对ALKBH5和其他加氧酶并没有抑制作用，可见这些药物对靶点的特异性选择已经明显提高。
4.4 动物实验
三者在体外实验和细胞实验的结果上没有明显差别，而在黄牛等人已经完成的高脂肪饮食摄入诱导的肥胖动物模型实验，结果表明连续喂养高脂饮食的大鼠(实验组)，如果同时摄入恩他卡朋在一段时间后体重会比未摄入的(对照组)轻11%，但是相对摄食量(用实际体重较正)没有明显变化。实验组的大鼠体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)浓度也比对照组下降了40%，同时脂肪细胞显著变小，肝脂肪变性水平下降，预示着这些大鼠更加健康。
在LDL受体缺陷性小鼠中(ldlr-/-)，饮食中含恩他卡朋的实验组的主动脉窦附近区域的损伤明显低于对照组，化合物可能在抗动脉粥样硬化起作用。
在因连续喂食高脂食物导致肥胖的小鼠中，选取部分继续喂养高脂食物但同时摄入恩他卡朋，其余喂养脂含量正常的食物，喂养一段时间后实验组的平均体重明显下降大约10%。
这些动物实验表明恩他卡朋作为一种已经上市的药物可以被用来开发做FTO抑制剂治疗脂肪代谢异常引起的肥胖。
5. 前景与展望
虽然FTO被关注是因为其与肥胖有关，但是FTO在细胞内引导的m6A等底物的去甲基化在多个生物学进程中发挥关键作用。因此基于FTO的药物研发不仅仅可以治疗肥胖，还可以用于治疗Ⅱ型糖尿病 、心血管疾病 、高血压、中风，或癌症。例如恩他卡朋本身就是治疗帕金森病的药物，而甲氯芬那酸片适用于多种关节肿痛，二者皆是典型的老瓶装新酒，而早先发现的大黄酸本身更是一种常见的中药材。
当然除按医嘱服用药物，饮食、运动和情绪等生活方式干预措施均是肥胖管理不可或缺的部分。通过这些生活方式干预，患者将获得更大程度和更好的减重效果。
参考文献
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李 顼
博士毕业于PUMC和NIBS，长期从事生命科学第一线科研，主要领域为RNA干扰的结构生物学与生化机制研究，尤其擅长各类重组蛋白的纯化与优化，关注各种新靶点、创新药研究进展，擅长从多层次梳理药物作用机制。
微信号：ksrchen（中山王李顼）
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