配置PDA或DAD检测器液相色谱峰纯度检测及其应用(二)

本文接上篇：配置PDA或DAD检测器液相色谱峰纯度检测及其应用(一)

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概述

利用PDA或者DAD检测器的全波长数据采集存储能力，通过光谱的比对可以实现对色谱峰纯度的检测，以此达到判断是否有其他相关杂质共洗脱现象。前文介绍了通过比较光谱数据组向量之间夹角与噪音的cosine或者sine值的大小关系，进而实现色谱峰纯度的检测，其中就包括有Shimadzu LCsolution以及Waters Empower两类CDS，分别如下图1-1与1-2。

Fig.1-1 Peak purity determination by cosine with Shimadzu LCsolution

Fig.1-2 Peak purity determination by sine with Waters Empower

PDA或者DAD检测器实现色谱峰纯度检测的根本基础在于，对采集到的任一时刻的吸收光谱与参比吸收光谱进行对比。除了数据组向量的方式之外也有其他的实现方式，如相关系数法。

对于一个色谱峰而言，其任一时刻的吸收度均是样品浓度的线性函数，假设取色谱峰上的任意2个时间点的光谱，其中一条光谱在光谱范围内的吸光度作为纵坐标，另外一条光谱在光谱范围内的吸光度作为横坐标，分别进行线性回归分析。如果该色谱峰是纯的，在XOY坐标平面内的线性回归曲线的相关系数就会比较大，线性关系较好，反之，在XOY坐标平面内的线性回归曲线的相关系数就会比较小，如下图2所示。

Fig. 2 Peak purity determination by relevant coefficient

在线性回归的时候，其相关系数r的计算可按照下图3中公式进行，而图2中的Similarity则是相关系数r的平方乘以1000而来，最大为1000，最小为0，值越大色谱峰纯度也就越高，计算如下图4所示。

Fig.3 Formula for calculation of relevant coefficient

Fig.4 Formula for calculation of Similarity with Agilent ChemStation

按照该种方法对色谱峰纯度进行检测的就包括Agilent的ChemStation系统，其中Agilent会给出两种显示模式，如下图5所示。其中图5A为均一化视图窗口，图5B为相似度窗口。

 Fig.5 Peak purity determination by Similarity with Agilent ChemStation

无论是相关系数法或者数据组向量比较纯度角法对色谱峰的纯度进行检测的时候，其结果一般均是参考意义的，色谱峰纯度检测通过并不是色谱峰无共洗脱相关物质的充分必要条件。而且，一些PDA或者DAD检测器的采集参数或者数据处理参数的设置以及样品浓度的大小也会影响色谱峰纯度检测的结果，如检测器的光谱带宽设置，狭缝宽度的设置，光谱采集范围的设置，参比吸收光谱的选择，噪音的选择，样品的浓度等。

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色谱峰纯度检测结果的影响因素

任何影响色谱峰的吸收光谱的吸收度以及吸收光谱形状的参数设置，均会对色谱峰纯度检测结果产生或大或小的影响。

首先，PDA或者DAD检测器的光谱带宽的设置大小主要影响光谱的分辨率(resolution)，而对吸收度的影响与具体的化合物有关，一般带宽越宽，在一定范围内其吸收度越低。光谱带宽设置的越宽，其光谱的分辨率越小，设置的越窄，光谱的分辨率也就越高，如下图6所示。

Fig.6 Influence of bandwidth on the peak height and spectrum

光谱的分辨率越高，越能够真实的反映分析物的实际紫外吸收状况，对于色谱峰纯度检测越有益；当光谱带宽设置过大的时候，一些特征吸收位置可能会被平均掉，进而使得与相关杂质的吸收光谱之间的区分度降低，可能会得到与实际情况相反的纯度检测结果。

此外，需要注意的是，当光谱的带宽增加的时候，基线噪音减小；带宽减小，在增大分析物的吸收光谱的分辨率的同时，基线噪音也会变大。因此在保证吸收光谱具有足够的分辨率的情况下，并不需要一味地减小光谱带宽。

PDA或DAD检测器的狭缝宽度的大小，主要影响经光栅分光的光的强度。狭缝的宽度越大，能量越大；宽度越小，能量越弱。最明显的影响是对基线噪音的影响，一般地，狭缝宽度越大，基线噪音越小，如下图7所示。

Fig.7 Influence of slit width on the baseline noise and the spectrum

从上图7还可以看出，狭缝宽度的大小也会影响到分析物的紫外吸收光谱的形状以及吸收强度，因此也会对色谱峰纯度检测的结果造成一定程度上的影响。

采样光谱范围的大小，直接影响到用于对比的光谱数据组的维数或相关系数法中回归的点数，直接对色谱峰纯度检测的结果造成影响。如下图8所示，二者区别最大的区域在245 nm以下区域。当分别取200到310nm以及250到310nm作为光谱采样波长区间的时候，两种设置下的色谱峰纯度检测结果，将产生很大的差异。

Fig.8 The importance of the selectivity for different range of spectrum on peak purity determination

在实际情况下，采样光谱范围需要既能尽可能的覆盖所有特征吸收区间，又要尽可能的避开流动相以及添加剂的截止波长。

参比吸收光谱一般取吸收最大时刻的光谱，但也可自由设定，如下图9所示。不同的参比吸收光谱下，得到的色谱峰纯度检测结果可能不同，但也不排除出现相同的情况，如相关杂质与主峰完全共洗脱(分离度为0，如在ODS色谱柱上分离对映异构体)。

Fig.9 Influence of different reference spectrum on the peak purity determination with Agilent ChemStation

用于计算纯度检测的阈值一般由色谱工作站自动计算，但也可人为指定。自动计算的阈值与所选取的噪音有关系，选择不同时间段的噪音，可能会得出相反的色谱峰纯度检测结果，如下图10-1与图10-2所示。

Fig.10-1 An example of chromatogram with different noise interval for peak purity test

Fig.10-2 Influence of different noise interval on peak purity determination

从上图可以看出，在对色谱峰的纯度进行检测的时候，选取合适的基线噪音对得出合适的结果具有重要作用。在实际应用时，如果待检测色谱峰附近噪音比较稳定的时候，最好选择该位置，特别是对于梯度洗脱；对于等度洗脱的情况，选择无洗脱组分流出的一段时间内的噪音即可。

色谱峰积分方式也会对色谱峰的纯度检测结果产生影响，如下图11中，当选择如左图形式的积分的时候，色谱峰纯度检测通过，而采用右图的积分方式，则不能通过色谱峰纯度检测。在该例中，拖尾部分明显是另一个色谱峰，因此最合适的方式是分别进行积分，并对感兴趣的色谱峰进行纯度检测。

Fig.11 Influence of integration events on peak purity determination

在进行色谱峰纯度检测的时候，需要保证在整个采集光谱范围内的任意波长下，分析物的浓度均是不超载的。如下图12-1所示，当分析物的浓度超载之后，光谱形状发生明显的变异，在低浓度下，两条光谱完全一致。其对应的色谱峰纯度检测图如下图12-2所示。

Fig.12-1 Influence of sample concentration on spectrum

Fig.12-2 Influence of sample concentration on peak purity determination

如图12-2所示，在低样品浓度下，通过了色谱峰纯度测试，在超载浓度下，不能够通过色谱峰纯度测试，且纯度曲线呈现双底W形状。因此，保持合适的样品浓度，使得在整个光谱范围内的任意波长下均不超载，是进行有效色谱峰纯度检测的一个前提条件。一般地，在对色谱峰纯度检测的时候，控制最大吸收波长下的峰高< 1000 mAU (700-800 mAU比较合适)。

应用上，一般多见于分析开发的后期，比如最终的纯度测试分析方法，相关物质研究分析方法以及stability indicating测试分析方法。

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结论

以PDA或DAD检测器对色谱峰纯度检测的时候，既可使用纯度角的方式也可使用相关系数的检测方式。但无论使用何种形式，任何会影响紫外吸收光谱的吸光度以及形状的因素均会对色谱峰纯度测试结果产生一定程度的影响，如检测器的光谱带宽设置，狭缝宽度设置，光谱采集范围的设置，参比吸收光谱的选择，噪音的选择，色谱峰积分形式以及样品的浓度等。

作者信息

Bruce Lee

作者微信号：Lindaring001

作者公众号：Pharma_Analytical

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