丙肝神药索非布韦发现史

前言

2011年11月21日，一家总部位于美国新泽西州普林斯顿的制药公司“Pharmasset Inc ”吸引了医药界众多注意力，国际著名制药巨头吉列德(Gliead)以108亿美元的出价收购了该公司，原因很简单，因为Pharmasset的丙肝新药PSI7977(Sovaldi，即索非布韦)在临床试验中给出了极为优异的数据，可以说是丙肝治疗史上划时代的药物，也因为此，Gliead愿意以如此高昂的成本不惜收购这家公司来获得PSI7977的使用权，当然，这也为日后高昂的治疗费用埋下了伏笔，为社会所诟病。

图一

截止2015年世界上约有1.43亿人口感染了HCV，图一所示是1999年时的丙肝流行病学分布图，在欠发达地区，丙肝感染现象更为突出。在当时，丙肝(HCV)是极为难治疗的一种肝病，而且HCV会引起肝细胞的纤维化，并逐步导致肝硬化，进而发展成为肝癌，唯一有效的治疗方案是干扰素合并利巴韦林(一种广谱抗病毒药)，但是会引起严重的副作用，这或许也是Pharmasset大力开发抗丙肝药物的原因吧！

图二

HCV是一种具有包膜的RNA病毒，其结构如图二所示，核心为正义单链RNA，包膜上分布着糖蛋白，用以识别和侵入细胞。随着对HCV的深入研究，其基因组结构(如图三所示)也被揭示出来， 由9600个核苷酸组成，而根据基因组的不同，HCV又可被分为六种亚型，而这六种亚型中，又可被分为多种不同的子亚型，这也增大了丙肝的治疗难度。HCV基因组编码的蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白，其中的非结构蛋白NS5B为病毒的RNA聚合酶，众多周知，这是一个极佳的药物靶点，而Pharmasset的药物设计，也是针对这个蛋白进行的。

图三

故事的开始

图四

对于丙肝 48 31090 48 14939 0 0 2898 0 0:00:10 0:00:05 0:00:05 3007物的开发，在2000年以前就已经有不少报道了，但是一直未能取得重大进展，主要原因是没有一个比较好的筛选模型，HCV在体外的增殖比较难实现，直到Huh7培育方法的发现(见参考文献2 ”science”)。结合先前的抗HCV研究文献，Pharmasset的科学家决定以核苷类似物作为主要研究方向，通过新开发的Huh7细胞培养方式来筛选有效的化合物，2003年，经过不懈的努力，他们获得了第一个比较有效的化合物NHC，主要针对于病毒的RNA聚合酶，但是其活性还是比较低，并未达到理想的状态。

图五

NHC的发现给了大家极大的鼓励，Pharmasset对公司内部化合物库用之前提到的筛选模型进行筛选，转眼一年过去了，2004年，一个氟取代的化合物FdC进入了人们的视线(发现历程如图四所示)，EC90在0.1-200µM，比利巴韦林(EC90, 100µM)和NHC(EC90, 5µM)都要好一些(动物实验中，FdC活性的种属差异比较大)，而且研究结果显示FdC在细胞内三磷酸化后，即FdC-TP是一个有效的RNA聚合酶抑制剂，可是也会被细胞的RNA聚合酶所识别，但动物实验中，并未观察到明显的副作用，因此，FdC值得深入的研究。对FdC的研究发现了另外两个化合物，2'-C-Me-Cytidine和PSI6300，其中，化合物5是PSI6300经脱氨酶代谢后的产物，活性测试显示，PSI6300要优于FdC和2'-C-Me-Cytidine，因为2'-C-Me-Cytidine对S282T突变酶存在抗药性，而化合物5并未观测到明显的活性(其实化合物5就是索非布韦的核苷部分)！！！

图六

在对PSI6300进行机理研究时，发现真正发挥作用的并不是PSI6300，而是三磷酸化后的PSI6300，PSI6300在细胞内的磷酸化酶作用下依次发生磷酸化(如图五所示)，最终生成的PSI6300-TP是一种NS5B蛋白(RNA聚合酶)抑制剂。有意思的是，在分析PSI6300的作用机制时，在细胞内发现了有化合物5以及三磷酸化后的化合物5，因为脱氨酶细胞内是比较常见的一种酶，因此化合物5的存在不足为奇，先前的研究已经阐明，5是没有活性的，而在对三磷酸化后的5进行测试时，发现有明显的NS5B抑制活性。

图七

后来的研究发现，原来化合物5在细胞内不能被单磷酸化，而真正有活性的是三磷酸化后的产物，这也是为什么单独测试化合物5，并未发现有任何活性的原因。机理研究发现三磷酸化的化合物5是PSI6300在单磷酸化后再经脱氨化作用生成的，而单磷酸化后的5是可以顺利被其他磷酸酶所磷酸化的(如图六所示)，PSI6300在活性方面确实要比三磷酸化后的5好，可是存在一个比较严重的问题：半衰期仅仅只有4.8 h，而三磷酸化后的5半衰期长达38 h，PSI6300为了达到治疗效果，需要1000 mg的剂量，这个剂量确实有点惊人，因此故事就此发生了大的转折，一个本已经被扔进垃圾桶的化合物又被捡了起来。

图八

基于上述发现，化合物5被命名为RO2433，但是由于其不能被单磷酸化，所以必须要改造成单磷酸化后的形式，如PSI7672，才能顺利发挥效用，因此，氨基磷酸酯的前药策略成为了首选方式，在经过了多次优化和综合评价，化合物PSI7977的综合数据最好(PSI7976和PSI7977是一对非对映异构体，因为磷原子的手性而产生的)，而PSI7977也就是后来广为人知的索非布韦，在2013年，FDA批准了索非布韦的申报。

图九

WHO于2016年新颁布的丙肝推荐治疗方案(图八)中，都涵盖有索非布韦，可以说，索非布韦的发现为众多丙肝患者擦亮了未来的生活，“丙肝神药”的称谓当之无愧！

参考文献：

1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47(1), 244-254

2. Science, 290(5498), 1972-1974

3. Agents and Chemotherapy, 48(2), 651-654

4. Journal of Virology, 77(19), 10689-10694

5. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51(2), 503-509

6. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52(2), 458-467

7. Journal of Medicinal Chemistry, 48(17), 5504-5508

8. Journal of Medicinal Chemistry, 53(19), 7202-7218.

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