药物分析之"药物稳定性小悟"
一名药物化学工作者，工作范围不能仅仅局限于药物合成，药理、制剂、分析等工作亦不得不适当跟进，从而利于自己对锁定目标化合物的全方位了解以及对整个药物开发过程的领悟。而药物研发，作为一个系统工程，从研究、开发到生产上市，要经历许多个阶段，包括基础研究、模型的建立与开发、临床前研究、临床试验，以及注册审批与生产上市等阶段，在这些研发过程中，药物化学工作者关注更多的自然是基础研究，当确定待开发候选化合物时，分析工作自然会开始介入，为了更好的确定待开发候选化合物是否具有更好的成药性，药物稳定性研究工作就具有非常重要的指导意义(注：全文主要针对化学原料药的稳定性研究)。
药物稳定性及其研究简介
我国食药监总局对于化学药物稳定性研究所颁布的指导原则中指出，原料药(及其制剂)的稳定性是指其保持物理、化学、生物学和微生物学特性的能力，稳定性研究就是基于对原料药(及其制剂)生产工艺的系统研究和理解，通过设计试验获得原料药(及其制剂)的质量特性在各种环境因素的影响下随时间变化的规律，并据此为后续的药品处方、工艺、包装、贮藏条件和有效期/复检期的确定提供支持性信息。稳定性研究始于药品研发的初期，并贯穿于药品研发的整个过程，申请临床研究时要求临床前的稳定性结果应能保证临床试验期间试验用样品的稳定；申请生产上市时要求提交的稳定性资料应能保证产品上市后在一定期限内的稳定，并以此确定储存条件和有效期；而上市后生产企业作为产品的质量责任主体，应在产品获准上市后，对实际生产样品继续进行稳定性研究，以考察上市产品最终的稳定性，并可通过补充申请的形式修改贮存条件和有效期。
图1：稳定性研究的重要性
我国药品稳定性研究指导原则发展历程
国内最近的指导原则《化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则》，是在充分分析2005年版《化学药物稳定性研究技术指导原则》存在问题的基础上，参考2003年ICH修订的稳定性研究指导原则，以及2012年FDA发布的《仿制药稳定性研究指导原则(草案)》的基础上进行修订的。其中，2005年版《化学药物稳定性研究技术指导原则》存在“数据与商业化生产产品的实际结果差异较大、造成注册研究难以与商业化生产有效衔接等问题”；而ICH关于稳定性的指导原则共有5个，包括Q1A、Q1B、Q1C、Q1D和Q1E，其中Q1A是稳定性研究总的指导原则，“BCDE”则是不同方面的补充；《化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则》是在Q1A的基础上，纳入Q1B和FDA仿制药稳定性指导原则的内容，相当于化学原料药和制剂稳定性研究的总则，对简化的稳定性试验设计、结果的分析评估等在正文中有提及但未能展开阐述，后续根据需要将可能陆续起草或转化ICH Q1D和Q1E，现阶段药品研发单位及生产企业可根据需要，参考Q1D和Q1E中的相应内容。
三大稳定性试验
稳定性试验主要包括影响因素试验、加速试验和长期留样试验。影响因素试验的目的是明确药品可能的降解途径、初步为包装材料的选择提供参考信息；加速试验的目的是明确药品在偏离正常贮藏条件下的降解情况、确定长期留样试验的条件；长期稳定性试验的目的是确认影响因素试验和加速试验的结果，明确药品稳定性的变化情况，确定药品的有效期；应该说长期留样试验是稳定性试验的核心。
图2：稳定性试验在药物研发不同阶段的侧重点
影响因素试验
影响因素试验是通过给予原料药较为剧烈的试验条件，如高温、高湿、光照、酸、碱、氧化等，考察其在相应条件下的降解情况，以了解试验原料药对光、湿、热、酸、碱、氧化等的敏感性、可能的降解途径及产生的降解产物，并为包装材料的选择提供参考信息。通常供试品可用1批原料药物进行，将供试品置适宜的开口容器中(如称量瓶或培养皿)，分散放置厚度≤3mm，疏松原料药摊成≤10mm的薄层，进行以下试验，液体原料药应放在化学惰性的透明容器中。当实验结果发现降解产物有明显的变化，应考虑其潜在的危害性，必要时应对降解产物进行定性或定量分析。
图3：影响因素试验的3大重要组成部分
高温试验
供试品开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。若供试品含量低于规定限度，则在40℃条件下同法进行试验。若60℃无明显变化，则不在进行40℃试验。
高湿试验
供试品开口置恒湿密闭容器中，在25℃分别于相对湿度90%±5%的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，同时准确称量试验前后供试品的重量，以考察供试品的吸湿潮解性能。若吸湿增重5%以上，则在相对湿度75%±5%条件下，同法进行实验；若吸湿增重5%以下，其他考察项目符合要求，则不再进行此项试验。恒湿条件可在密闭容器如干燥器下部放置饱和盐溶液，根据不同相对湿度的要求，可以选择NaCl饱和溶液(相对湿度75±1%，15.5~60℃)，KNO3饱和溶液(相对湿度92.5%，25℃)。
强光照射试验
供试品开口放在装有日光灯的光照箱or其他适宜的光照装置内，总照度为1.2×106Lux.hr(此前为4500lx±500lx的条件下放置10天)，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。关于光照装置，建议采用定型设备“可调节光照箱”，也可用光橱，在箱中安装日光灯数支使达到规定照度。箱中供试品台高度可以调节，箱上方安装抽风机以排除可能产生的热量，箱上配有照度计，可随时监测箱内照度，光照箱应不受自然光的干扰，并保持照度恒定，同时防止尘埃进入光照箱内。此外，根据药物的性质必要时可设计试验，探讨pH值与氧及其他条件对药物稳定性的影响，并研究分解产物的分析方法。创新药物应对分解产物的性质进行必要的分析。
加速试验
加速试验主要用于评估短期偏离标签上的贮藏条件对原料药质量的影响，目的是通过加速药物的化学和物理变化，探讨药物的稳定性，为制剂设计、包装、运输、贮存提供必要的资料。供试品要求3批，放置在商业化生产产品相同或相似的包装容器中，在温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月。所用设备应能控制温度±2℃、相对湿度±5℃，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，按稳定性重点考察项目检测。在上述条件下，如6个月内供试品检测不符合制定的质量标准，则应在中间条件下即在温度30±2℃、相对湿度65±5%的情况下(可用Na2CrO4饱和溶液，30℃，相对湿度64.8%)进行加速试验，时间仍为6个月。加速试验，建议采用隔水式电热恒温培养箱(20~60℃)。箱内放置具有一定相对湿度饱和盐溶液的干燥箱，设备应能控制所需温度，且设备内各部分温度应该均匀，并适合长期使用。也可采用恒湿恒温箱or其他适宜设备。对温度特别敏感的药物，预计只能在冰箱中(4~8℃)保存，此种药物的加速试验，可在温度25±2℃、相对湿度60±10%的条件下进行，时间为6个月。
长期试验
长期试验是在接近药物的实际贮存条件下进行，其目的是为制定药物的有效期提供依据。供试品3批，放置在商业化生产产品相同或相似的包装容器中，在温度25℃±2℃，相对湿度60%±10%的条件下放置12个月，或在温度30℃±2℃、相对湿度65%±5%的条件下放置12个月，这是从我国南方与北方气候的差异考虑的，至于上述两种条件选择哪一种由研究者确定。每3个月取样一次，分别于0、3、6、9、12个月取样按稳定性重点考察项目进行检测。12个月以后，仍需继续考察，分别于18、24、36个月，取样进行检测。将结果与0个月比较，以确定药物的有效期。由于实验数据的分散性，一般应按95%可信限进行统计分析，得出合理的有效期。如3批统计分析结果差别较小，则取其平均值为有效期，若差别较大则取其最短的为有效期。如果数据表明，测定结果变化很小，说明药物是很稳定的，则不做统计分析。对温度特别敏感的药物，长期试验可在温度6℃±2℃的条件下放置12个月，按上述时间要求进行检测，12个月以后，仍需按规定继续考察，制订在低温贮存条件下的有效期。长期试验采用的温度为25±2℃、相对湿度为60±10%，或温度30±2℃、相对湿度65±5%是根据国际气候带制定的。
稳定性试验需要关注的问题
分析方法方面
如果在稳定性研究过程中分析方法发生了变更，则用变更前后的2种方法对相同的试验样品进行测定，以确认该方法的变更是否会对稳定性试验结果产生影响。如果方法变更前后的测定结果一致，则可用变更后的方法进行后续的稳定性试验；如果方法变更前后测定结果差异较大，则应考虑用2种方法平行测定后续的时间点，并通过对2组试验数据的比较分析得出相应的结论；或是重复进行稳定性试验，获得包括前段时间点的完整的试验数据。
试验数据的统计分析
首先要分析何时进行统计分析？如何进行统计分析？如果稳定性数据显示试验原料药或制剂有降解趋势，且批次间有一定的变异，则需要进行统计分析。通常用的统计分析方法是回归分析，包括线性回归和非线性回归。用正式稳定性研究中长期试验可定量测定的、随时间变化的质量属性(含量、降解产物)进行统计分析；制剂配方时尽可能保证放行时含量为标示量的100%，以避免高估或低估有效期(复检期)；对每个可统计分析的质量属性分别进行分析，依据其中最短的时间建立有效期(复检期)；批间变异是指批次线性回归的斜率和截矩之间的变异，P>0.25为无显著差异，可合并批进行分析。
合成中对化合物稳定性的感悟
通过对药物分析过程中稳定性问题的学习，在下认为许多“关键值”可以转移到合成工作当中，如温度、湿度、光照、存放方式、存放时间等。先说温度，稳定性试验中的温度通常为40℃或60℃，那么，我们在合成过程中就可以下意识的对反应温度和重结晶温度进行适当的考察，观察产品在60℃及更高的温度是否存在杂质的产生；而对于湿度，不得不说，身处北方的小伙伴对此感受绝对没有南方的小伙伴强烈，由于许多合成反应对水分的要求非常严格，甚至在阴天、下雨等天气最好避免某些反应的进行，故而湿度95%的情况下，反应是否有影响，产品是否会吸潮、变质等等，对终产品的质量相当重要；而光照问题，我们也可以在日常的合成过程中下意识的注意到，如已点样的薄层板在紫外灯(或日光)下是否存在变化，时间长是否存在变化等，这些细节都可间接的体会你所笃定的化合物的某些理化性质；过滤产物时，合成人员也可适当的将过滤产物摊成稳定性试验所要求的厚度，在一定的时间内观察其是否存在颜色的变化，等等。当然，以上细节问题我们大都可以将产品交给分析部门来做，不过，药物化学工作者在进行大量化合物合成过程中，寻找“活性好”的候选化合物的同时，再加以分析的思路，来理解你所笃定的化合物的一些成药性问题，也许会更加事半功倍。在下认为，如果说合成工作是药物化学工作者的主干，那么，分析、药理、制剂等相关学科便是分支，相信只有主干和分支的充分融合，这棵药物研发大树才会真正的根深枝茂！
(以上为个人所感，如有错误之处，敬请原谅)
参考文献：
1. 霍秀敏，魏农农，何伍，等. 解读《化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则》[J].
2. CFDA官网. 化学药物(原料药和制剂)稳定性研究技术指导原则 (2015-02-05).
3. ICH药物稳定性试验指导原则.
4. FDA《仿制药稳定性研究指导原则(草案)》.
5. 图片来源于网络.
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