靶向GPCR的单抗类药物研发现状

Activation of the Galpha subunit of a G-protein-coupled receptor

G蛋白偶联受体简介

(GPCR，G-protein-coupled receptors)在人体中有超过800种家族成员，其中包括370类以上的非嗅觉功能性受体。GPCR、G蛋白及下游信号通路的功能异常或突变的产生往往跟很多人类疾病相关，通过药物对GPCR功能进行干预也已成功应用于诸多疾病的治疗，如心血管疾病、内分泌学、神经系统和免疫系统的疾病。毫不意外，目前包括处方药在内所有的获批上市药物中，约有40%通过作用于GPCR而发挥作用。GPCR信号可做用于细胞内的多条信号传导途径。相应的激活剂结合后，会导致GPCR发生构象变化从而通过异源三聚体的G蛋白影响下游信号。活化后的GPCR同G蛋白的结合会导致分子亚基中GDP与GTP的交换，以及G蛋白亚基的解离。Gα与Gβγ随后会激活下游信号通路，导致胞内cAMP或钙离子水平的改变、激活或抑制离子通道、激活其他一些级联信号通路。GPCR信号的终止也存在多种机理，包括配体的解离、受体被特异性激酶磷酸化、β‑arrestin的结合以及受体的内吞过程。

G蛋白偶联受体参与众多生理过程，包括但不限于下述作用。

感光：视紫红质是一大类可以感光的G蛋白偶联受体，它们可以将电磁辐射信号转化成细胞内的化学信号，引导这一过程的反应称为光致异构化(Photoisomerization)，具体细节为由视蛋白(Opsin)和辅因子视黄醛共价连接所构成的视紫红质在光源的刺激下，分子内的视黄醛会发生异构化，从“11-顺式”变成“全反式”，这个变化进一步引起视蛋白的构象变化从而激活与之偶联的G蛋白，引发下游的信号传递过程。

嗅觉：鼻腔内的嗅上皮(Olfactory epithelium)和犁鼻器上分布有很多嗅觉受体，可以感知气味分子。

行为和情绪的调节：哺乳动物的脑内有很多掌控行为和情绪的神经递质对应的受体是G蛋白偶联受体，包括血清素，多巴胺，γ-氨基丁酸和谷氨酸等。

免疫系统的调节：很多趋化因子通过G蛋白偶联受体发挥作用，这些受体被统称为趋化因子受体；其它属于此类的G蛋白偶联受体包括白介素受体(Interleukin receptor)和参与炎症与过敏反应的组胺受体(Histamine receptor)等。

自主神经系统的调节：在脊椎动物中，交感神经和副交感神经的活动都受到G蛋白偶联受体信号通路的调节，它们控制着很多自律的生理功能，包括血压，心跳，消化等。

细胞密度的调节：最近在盘基网柄菌中发现了一种含有脂质激酶活性的G蛋白偶联受体，可以调控该种黏菌对细胞密度的感应。

维持稳态：如机体内水平衡的调节等。

Two-dimensional schematic of a generic GPCR set in a Lipid Raft

经典的GPCR分子由三部分构成，分别是胞外长度约10-600个氨基酸的N段结构域、7次跨膜的α螺旋结构域(TMDs)及胞内的C端区域。胞外区域的抗体表位主要包括N端结构域以及3个胞外的环状区域(ECL1-3)。这些胞外区域可能以无固定结构的可变柔性区域存在，也可能形成固定的二级结构；同时还伴随着高频率的糖基化现象发生。GPCR的胞外Loop大小不一，分布范围在5-170个氨基酸之内。在很多种GPCR成员中，存在一个高度保守的二硫键，从而将α螺旋3的顶部同ECL2连接在一起。N端结构域则随着超家族的不同而变化巨大。

已开发的靶向于GPCR分子的药物主要是小分子药物及低分子量的多肽类药物。然而，考虑到单克隆抗体药物相比于小分子药物的诸多好处，以及获得某些靶向于特定GPCR小分子药物的困难性，医药工业界对于靶向于GPCR分子的单克隆抗体类药物的研发兴趣日益增加。

单抗类药物在靶向GPCR中的优势

Potential mAb interactions with a GPCR

尽管GPCR家族在所有成药性靶点中占比最大，但仍有四分之三的GPCR成员尚未被开发成药物靶点；目前只有约80种GPCR分子具有相对应的小分子药物，近30种GPCR分子相应药物为多肽分子，通常与人体内自然存在的配体相关。针对GPCR靶点的药物开发主要受困于寻找到具有合适选择性以及类药物性质的分子。对于小分子药物而言，其通常结合在配体结合的保守位点，因而对于相近的受体成员间的选择性较差；而抗体则具有很高的特异性，还可靶向于非保守的位点区域。另外，对于高通量筛选而获得的小分子化合物，往往还存在因高度亲脂性及分子量特点所带来的药物脱靶毒性。

相比于小分子药物，单克隆抗体类药物具有以下优点：具有更佳的特异性、用药频率优势以及能够有限制的渗透入中枢神经系统，从而有潜力作用于小分子在体内接触不到的靶点。除此之外，单抗类药物在不同患者个体间的药代动力学差异很小；并可通过人源化方式去除潜在的T细胞抗原表位，或者选择合适的给药途径来降低免疫原性的风险。除了具有所需的选择性、高度靶点亲和力以及提升的血浆半衰期外，单抗类药物还能通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，补体依赖的细胞毒性(CDC)及抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)而杀死细胞。另外，单抗类药物还存在不同形式，比如抗体片段、双特异性及多特异性抗体以及抗体偶联药物(ADC)等。

除此之外，单抗类药物相比于小分子及多肽类药物还有其他一些优点。比如，CCR4特异性的单抗药物mogamulizumab在CCR4拮抗剂缺失的情况下可通过消除恶性CCR4阳性的T细胞而发挥作用；目前尚不清楚采用小分子CCR4拮抗剂类药物能否达到相似的治疗效果。单抗类药物作用于受体的胞外区域，可以稳定多种不同的分子构象；而小分子药物只能作用于TMD结构域。总体上单抗类药物可以通过多种方式改变GPCR信号，而其中一些同小分子药物的作用机制完全不同。首先，单抗分子可以封闭天然配体在受体上的结合，或者结合于相同或者重叠的区域，或者作用于活性位点外的区域。其次，抗体有可能通过空间位阻而直接封闭掉配体进入结合位点的可能。第三，抗体的结合能够稳定受体的非活化状态，从而阻止对于G蛋白或其它信号传导所必须的构象变化的发生。第四，抗体可以在天然配体缺失的情况下，通过稳定受体活化形式而激活信号通路。抗体可以通过降低激活剂的解离等级制，稳定激活剂结合的受体构象，从而增加信号的传导。第六，抗体有可能引起受体的内吞，从而降低信号强度。第七，双价抗体有望通过促进分子的二聚化而改变GPCR信号的传导。以上作用机制如上图所示。

最后，生物制品类药物(单抗类药物占据了绝大多数)的总体失败率远小于小分子药物：约有25%的进入临床前研究的生物制品最终获批上市，而对小分子药物而言这一数字为7%。另外，在研发过程的任一阶段，生物制品表现都要优于小分子药物，并且具有更高的转化率。

靶向GPCR的单抗类药物应用领域

The landscape of GPCRs targeted by antibodies

GPCR成员可通过序列保守性而在人类基因组中加以确认；但仍有很多分子目前其相应的内源性配体未知，被称为孤儿受体。尽管科学家们做了很多常来试图确认这些受体的天然配体，迄今仍有127种受体尚处于孤儿状态。GPCR家族中的孤儿受体具有很高的药物靶点开发价值，因为他们中的很多同众多疾病密切相关，如癌症、精神紊乱、糖尿病与肥胖以及各类炎症性疾病等。从另一个角度讲，直接作用于孤儿GPCR的抗体是一种探索该类受体功能机理的很好的工具，有望阐明他们在疾病中的靶点性作用；同时也是在配体未知情况下，开发靶向于该类别受体药物的一种有效方式。与功能相对应，靶向于GPCR分子的抗体类药物有望在多个疾病治疗领域发挥作用，目前占比较大的仍是癌症、炎症性疾病及代谢性疾病三大类别。

靶向GPCR的单抗类药物研发现状

GPCR-targeting antibodies in clinical development

随着单抗类药物开发技术的进步，GPCR也成为该类别药物开发的热点，目前主要工作集中于肿瘤学、炎症性疾病、自体免疫性疾病及代谢性疾病；另外也有很多研发项目在感染性疾病、疼痛、偏头疼和纤维化等领域开展。靶向于GPCR家族的单抗类药物管线正吸引了越来越多的商业关注，进入了快速发展的轨道。目前至少有74个研发项目集中于37种GPCR分子上，共有57中单抗类药物正处于发现及临床前研究阶段，而39种则已经进入了不同的临床研发阶段；各项数字相比于2010年有了巨大飞跃，部分在研药物信息总结如下。

Mogamulizumab

Mogamulizumab

迄今为止，只有Mogamulizumab一种靶向于GPCR的单抗类药物获批上市。Mogamulizumab由日本协和发酵麒麟株式会社(Kyowa Hakko Kirin)研发，于2012年3月30日获得日本PMDA批准上市并在日本市场销售，商品名为Poteligeo®。Mogamulizumab是一种靶向于CC趋化因子受体4 (CCR4)的人源化单克隆抗体，CCR4则是表达于调节T细胞和辅助T细胞上的G蛋白偶联受体(GPCR)。该药批准的适应症为CCR4阳性成人T细胞白血病、CCR阳性外周T细胞淋巴瘤和CCR4阳性皮肤T细胞淋巴瘤。Poteligeo®是一种静脉滴注用溶液，每瓶共5mL含20mg Mogamulizumab。推荐剂量为每次1mg/kg，每周一次，共8次。

潜力研发方向

伴随着抗体开发技术及靶点生物学功能基础研究的推进，抗体药物的发现及开发过程也迎来了快速发展期。除了经典抗体药物研发路线外，新技术平台基础上的以下研发思路也值得重视：

Mechanism of ADC

抗体偶联药物(ADC)

抗体偶联药物占据了所有单抗类药物临床研发管线的11%，如果只看针对肿瘤领域的研发管线，则占比高达20%。近几年，全球已掀起抗体药物偶联物(ADC)研发的热潮。ADC类药物被认为能够更加高效和有效的治疗肿瘤等疾病，在未来将成为治疗疾病的重要手段。根据全球知名市场调研公司Research & Markets发布的一份报告，未来10年，ADC市场将经历飞速发展。目前，FDA总共批准了3种ADC药物(Mylotarg，Adcetris，Kadcyla)上市，其中Mylotarg于2010年从美国撤市。未来10年，预计将会有7-10个ADC新药上市，2024年ADC市场将达到100亿美元。

LGR5是第一个被用于ADC药物靶向的GPCR成员，其他还包括一类新型人源化的靶向CXCR4的ADC类药物，可输送LCK抑制剂Dasatinib至人体T淋巴细胞用于选择性的免疫抑制；以及通过AmbrX制备的靶向于CXCR4的ADC，可用于免疫性疾病及银屑病的治疗。近期还有一类可将基于Auristatin的微管抑制剂类药物输送至内皮素B受体的ADC正在开展临床前测试，来观察单独给药或同BRAF及MEK激酶小分子抑制剂联用时对黑色素瘤的治疗效果。实验中发现，抑制BRAF或MEK的活力会增加内皮素B受体的表达量，从而可以提升该ADC药物的抗肿瘤活性；目前该抗体已在黑色素瘤中开展一期临床研究。另外，一种靶向于FZD7的ADC类药物也已被Concortis公司列上研发管线。伴随着GPCR作为靶点基础生物学研究的深入，以及人类对于生物制剂及化学物靶点选择性的掌控，将会逐步提高ADC类药物的疗效，并降低脱靶效应的影响。

Schematic overview of the different strategies used to generate bispecific antibodies (bsAbs)

双特异性抗体

双特异性抗体占据了所有单抗类药物临床研发管线的9%，如果只看针对肿瘤领域的研发管线，则占比提升至11%。迄今为止，总共有两种双特异性抗体获批上市，1种处在三期临床阶段，12种处在二期临床阶段，41种则正在开展一期或一/二期临床研究。对于肿瘤适应症而言，约有一半的双特异性抗体靶向于肿瘤特异性抗原及CD3，从而引导T细胞至肿瘤细胞，而使其选择性杀死肿瘤细胞。双特异性抗体相比于小分子药物，多肽类药物及单纯的单抗类药物有优势，并且能够克服肿瘤细胞的多重耐药性。预计未来的6-8年，将会有更多的双特异性抗体类药物获得批准上市。

MCLA-158是一类靶向于LGR5及EGFR的双特异性抗体，目前正开展针对结直肠癌的临床前研究，并计划于2017年底启动临床研究。该药物采用了Merus公司的独特技术开发，采用了两种不同的作用机制：阻断肿瘤干细胞生长及存活的信号通路；召集并促进免疫因子细胞对于肿瘤干细胞的直接杀伤作用，后者往往存在于实体瘤中并于肿瘤的复发及转移密切相关。

A shark (left) and a camelid (middle) heavy-chain antibodyin comparison to a common antibody (right)

单域抗体

其他类别的抗体形式或蛋白支架类药物同样可用来靶向于GPCR分子。这些不同的抗体形式为探索GPCR分子的识别决定因子提供了多样化的工具；并且当克服了免疫原性及药代动力学的诸多问题后，有望开发成为新型药物。纳米抗体使用的单域抗体平台来自免疫羊驼和仅有重链的抗体库。最小的抗体来源的结合结构为独立的V型结构域。最新的研究发现，骆驼及软骨鱼类具有的高亲和力的V型结构装载于Fc等效性结构与上作为他们免疫系统的一部分。这些V型结构域在骆驼中称之为VHH或纳米抗体，而在鲨鱼中则称之为VNARs。骆驼中的纳米抗体通常分子量为12-15kDa。除了用于GPCR结构研究外，一些靶向于GPCR的纳米抗体也在药物发现过程中脱颖而出。目前两类分别靶向于CXCR2及CX3CR1的纳米抗体已经进入了一期临床研究阶段，分别用于肿瘤及慢性肾病的治疗；另有一类CXCR4-CD4双特异性纳米抗体用于阻断艾滋病毒感染。

总结

作为一类重要的药物靶点分子，GPCR在药物开发领域吸引着越来越多的关注，特别是在单抗药物开发领域。越来越多的临床药物实验拓展至靶向GPCR的抗体药物中。人类对于GPCR在肿瘤学中生物性质的认识，特别是肿瘤免疫学方面，已经极大推进了该领域靶向治疗药物的研发。新一代蛋白药物开发策略的应用，如双特异性抗体及抗体偶联药物等，也推动了该领域的前进。考虑到科研人员在通过突变或过表达受体方式在稳定受体分子领域取得的进展，尽管一些技术性的障碍依旧存在，但并非不可克服。以上基础研究的进展，连同高通量筛选技术的进步、对GPCR结构的深入了解，及生物学/临床学意义的阐释，将会为靶向GPCR的抗体药物发现及开发过程中遇到的技术性瓶颈的解决，打下坚实的基础。

缩略词：

ATL:adult T cell lymphoma

C5aR:C5a anaphylatoxin receptor

CB1:cannabinoid receptor 1

CCR:C-C chemokine receptor

CGRPR:calcitonin gene-related peptide receptor

CRTH2:chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on T helper 2 cells

CX3CR1:CX3C chemokine receptor 1

CXCR:C-X-C chemokine receptor

EGFR:epidermal growth factor receptor

ELTD1:EGF，latrophilin and seven transmembrane domain-containing protein 1

FZD:  Frizzled

GCGR:glucagon receptor

GLP1R:glucagon-like peptide 1 receptor

GPCR:G-protein-coupled receptor

GVHD:graft-versus-host disease

LGR:leucine-rich repeat-containing GPCR

NSCLC:non-small-cell lung cancer

PTCL:peripheral T cell lymphoma

RSPO3:R-spondin 3

S1PR3:sphingosine 1‑phosphate receptor 3

SLE:systemic lupus erythematosus

T2DM:type 2 diabetes mellitus

参考文献：

1.https://en.wikipedia.org/wiki/G_protein-coupled_receptor

2.Therapeutic antibodies directed at G protein-coupled receptors. MAbs. 2010 (6):594-606.doi: 10.4161/mabs.2.6.13420.

3.Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupled receptors. Nat Rev Drug Discov. 2017 Sep； 16 (9):1-24. doi:10.1038/nrd.2017.91.

4.Discovery of functional monoclonal antibodies targeting G-protein-coupled receptors and ion channels. Biochem Soc Trans. 2016 Jun 15； 44(3):831-7. doi: 10.1042/BST20160028.

5.Development of therapeutic antibodies to G protein-coupled receptors and ion channels:Opportunities，challenges and their therapeutic potential in respiratory diseases. Pharmacol Ther. 2017 Jan ；169 : 113-123. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.04.013

6.Discovery of functional antibodies targeting ion channels. J Biomol Screen. 2015 Apr；20 (4):454-67. doi: 10.1177/1087057114560698.

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