肉毒素的故事——不只用于美容
肉毒杆菌及肉毒素
肉毒素简介
肉毒毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由厌氧的肉毒杆菌在生长繁殖过程中产生的一种细菌外毒素，它能引起死亡率极高的中毒。自古以来，倒在这种毒素下的人类生命不计其数，而且在西方尤其多见。西方人很早就发现，吃肉制品容易发生肉毒素中毒症。Botulinum这个词汇，就源自于“肉肠”的拉丁文botulus；而中文译为“肉毒素”也是这个缘故。在分子数相同的条件下，其致死力是白喉毒素的300倍，蓖麻毒素的3万倍，银环蛇毒素的300万倍，箭毒的10亿倍，是目前已知的毒力最强的分子，被美国疾病控制预防中心(CDC)列为A级生物恐怖剂。
肉毒梭菌及其毒素根据毒素抗原性的不同，将其分为A、B、C、D、E、F和G七个亚型。其中A、B、E、F为人中毒型别，C、D型为动物和家禽的中毒型别。C型肉毒梭菌在自然界广泛分布。饮食污染有C型肉毒梭菌特别是C型肉毒毒素的水源或草料的动物有可能发生C型肉毒中毒。动物中毒后，20小时左右甚至几小时内即可致死，死亡率极高，常常来不及用抗毒素进行特异性治疗。肉毒中毒发生后，若不及时采取措施，则会引起其它食肉动物因食用中毒动物尸体而死亡或携带肉毒梭菌，造成肉毒梭菌在自然界中的传播与潜伏，有可能引起范围更广、更严重的肉毒中毒，并危害人类健康。
肉毒毒素不耐热，90℃情况下2分钟可完全破坏；不耐碱，溶解在pH11的碱性溶液中3分钟就可灭活。肉毒毒素溶液加0.6%的福尔马林37℃下作用一个月以上可失去毒性，但仍保持抗原性和免疫原性，成为类毒素。肉毒素对乙醇稳定；但可被卤素灭活。粗制毒素较精制毒素稳定。毒素溶液在pH6.0，4℃下保存，效价可保持半年不变。冻干毒素在低温条件下可长期保存，毒性下降缓慢。
肉毒素发现及应用史
19世纪20年代：德国医生Justinus Kerner从变质的香肠中发现了一种引起食物中毒的毒素。由于Kerner的“香肠之毒”导致麻痹瘫痪性疾病，因而获得了“肉毒之毒”(来源于拉丁文“botulus”)的称号。Kerner推测，小剂量的肉毒素也许可以用于治疗神经紊乱性疾病以及多汗症。1895年，比利时细菌学家Emile Pierre van Ermengem发现，肉毒杆菌可以产生肉毒素。20世纪20年代，美国旧金山加利福尼亚大学的Herman Sommer博士以稳定的酸沉淀形式最先从肉毒杆菌中提炼出A型肉毒素。
20世纪40年代，第二次世界大战期间，美国科学家开始探索肉毒素的潜在用途，试图将它变成战争的武器。1949年，在英国伦敦，研究人员Arnold Burgen博士和他的同事们发现，肉毒素可以阻断神经和肌肉的联系。20世纪60年代，旧金山眼科医生Alan Scott将肉毒素注射入猴子体内，观察它们是否可以令导致斜视的肌肉放松下来。1978年，Scott医生获得了美国食品和药物管理局(FDA)的批准，进行关于肉毒素用于治疗人类斜视问题的广泛动态测试。他将这种药物命名为Oculinum，并且创建了Oculinum公司来生产及出售这种药物。1989年，Oculinum获美国FDA批准用于治疗斜视及眼睑颤动。
1986年，加拿大Carruther夫妇在用肉毒杆菌毒素治疗眼睑痉挛时，意外的发现了其良好的除皱效果。随后，他们相继用肉毒素对额纹、眉间纹、鱼尾纹进行了治疗，经过了一系列尝试，于1992年首先报道，Carruther夫妇就成了此项技术的发明者和先驱。2002年4月15日，肉毒素获美国FDA批准用作医学美容材料，主要用于注射除皱，暂时性地改善中度至重度的眉间皱纹，这一重大事件无疑使肉毒素成为爱美人士的“面部救星”。时至今日，肉毒素仍然是很多爱美之人瘦脸、除皱的理想选择。1993年，中国兰州生物制品研究所自主研发的A型肉毒素制品——衡力问世。2006年，GSK在中国上市保妥适(BOTOX)。
肉毒素的作用机制
Crystal structure of botulinum neurotoxin A1 (BoNT/A1)
肉毒素是一种蛋白类毒素。菌株细胞内所翻译的原初蛋白为150kDa的一条多肽链；随后通过蛋白酶的作用，在跨越二硫键的环状区域进行切割，形成成熟的肉毒毒素，由50kDa的轻链(L链)及100kDa重链(H链)构成，如上图所示。重链和轻链之间通过一个分子内二硫键及不同结构域间的非共价相互作用而构成三维结构。目前科学人员已经解析了BoNT/A1，BoNT/B1及BoNT/E1的晶体结构。同其他作用于细胞内靶点的细菌毒素类似，BoNT也由功能不同的结构域所组成：轻链编码毒性功能区，为一金属蛋白酶活性区域，能够特异性切割SNARE家族蛋白，后者对于神经递质的分泌是必须的；HN结构域对于轻链穿越内吞小体转位至神经元细胞质至关重要；而HC结构域负责突触前结合和内吞，其自身由两个不同结构的亚结构域所构成。氨基酸序列的保守性及结构分析表明：BoNT/C， BoNT/D和BoNT/G同BoNT/A及BoNT/B较为相似；而BoNT/E同BoNT/F之间相似度更高。肉毒毒素通常是由神经毒素和血凝素组成的复合形式存在。
Neurotransmission at synapses
肉毒素的毒性机理主要为抑制神经递质对细胞信号的传递过程。化学突触中的信号是由神经递质介导的，这些神经递质从突触前神经末梢释放出来，并与位于突触后细胞(如肌肉或外分泌细胞)的受体结合。神经递质在神经元胞浆中合成，并储存在突触前神经末梢内的小突触小泡中。在突触囊泡腔中神经递质的积累主要是由质子电化学梯度所驱动，后者由ATPase质子泵产生的，它位于突触囊泡膜上并利用ATP水解释放的能量将ATP泵入突触小泡。突触小泡在神经末梢形成一个神经递质的储备池，并与突触前膜成为活性区域的特定部位结合，称为“docking”。多种蛋白分子逐步形成一个较大的复合体，来完成突触小泡的docking过程。该复合体包括两个突触囊泡上的膜蛋白，VAMP (synaptobrevin)及Syt (synaptotagmin)；两种位于突触前膜的蛋白，SNAP25及syntaxin；以及胞浆蛋白complexin和Munc18，来参与后续步骤，即使得突触囊泡能够响应钙离子内流的信号而快速同突触前膜区域相融合。Syt分子同突触前膜上的肌醇磷脂分子相互作用，而VAMP则同SNAP25及syntaxin形成coiled-coil结构，也被称之为SNARE复合体。Docking过程完成后，complexin同Munc18一起发挥刹车的作用而阻止融合过程的即刻发生，并促进其他蛋白形成一个更大的超级SNARE复合体，这也是介导神经递质释放的最核心结构。神经末梢的去极化会导致膜上钙离子通道的打开以及大量钙离子的进入，从而引发复合体的快速构象变化，使得突触囊泡与突触前膜融合而将神经递质释放至突触间隙。神经递质扩散到神经末梢，并与突触后受体结合，从而触发突触后细胞的信号传导。在神经递质释放过程中，突触囊腔瞬时对外开放，但随后通过内吞作用内化入神经末梢。神经递质的胞吐和内吞是严格耦合的：一个过程的抑制导致另一个过程的抑制。内化和脱壳后，突触小泡再次填充入神经递质，神经传递的下一个周期重新开始。
Binding and trafficking of botulinum neurotoxins inside nerve terminals
在体内，肉毒毒素特异性的与胆碱能神经末梢突触前膜的表面受体相结合，然后由于吸附性胞饮而内转进入细胞内称为毒素的内转(internalization)，使囊泡不能再与突触前膜融合，从而有效地阻抑了胆碱能神经介质——乙酰胆碱的释放。与此同时，毒素与突触前膜结合，还阻塞了神经细胞膜的钙离子通道，从而干扰了细胞外钙离子进入神经细胞内以触发胞吐和释放乙酰胆碱的能力。乙酰胆碱释放的抑制，有效地阻断了胆碱能神经传导的生理功能，尤其是神经——肌肉接头部位特别敏感，引起全身随意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。
肉毒素的应用
20世纪70年代初美国旧金山眼科研究所的Scott医师从肉毒中毒病人最先累及眼外肌，引起视力模糊、眼睑下垂、瞳孔散大和复视等症状并缓慢恢复的过程中得到启示，与世界著名肉毒毒素专家、美国威斯康星大学食品微生物及毒素学系Schantz教授合作，在猴实验基础上将肉毒毒素引入眼科疾病治疗，并在1980年首次报告眼外肌注射A型肉毒毒素替代斜视手术治疗的可能性。此后他和其他临床专家对肉毒毒素的临床效果、副作用及免疫学反应进行了大量的实验研究，并在斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛等疾病的治疗中取得了令人鼓舞的结果。迄今，国外报道肉毒毒素已可用于眼科、神经科、康复科、消化科、泌尿科、皮肤科及美容科等50余种病症(很多是疑难杂症、难治之症)的治疗。
肉毒素类药物中的明星BOTOX(保妥适)
市售的A型肉毒毒素产品至少有6种：OnabotulinumtoxinA (美国BOTOX，Allergan)，BTXA (中国衡力，兰州生物制品研究所)，Abobotulinumtoxin A (英国Dysport，Ipsen Ltd)，Rimabotulinumtoxin B (美国Neurobloc，Solstice Neurosciences)，neu-BoNT/A (韩国Neuronox，Medytox)，Incobotulinumtoxin A (德国Xeomin，Merz Pharmaceuticals)。这些产品根据分子特性和血清类型分为3类：A型复合肉毒毒素(onabotulinumtoxin A，bobotulinumtoxin A，BTXA和neu-Bo NT/A)、A型复合游离肉毒毒素(incobotulinumtoxin A)和B型肉毒毒素(rimabotulinumtoxin B)。这其中，onabotulinumtoxin A自1989年在美国获批后一直占据市场，Abobotulinumtoxin A紧随其后，自2009年FDA批准其用于治疗颈部肌张力障碍和重度眉间纹后，就一直在欧洲、亚洲、拉丁美洲和美国应用。Incobotulinumtoxin A于2005年在德国问世，在美国应用。neu-BoNT/A于2006年在韩国获批用于治疗眼睑痉挛，已在亚洲和拉丁美洲国家成为最为接受的肉毒毒素产品之一，在日本、韩国、泰国等用于治疗和美容适应症。对于肉毒素类产品适应症多样性的研究正如火如荼的展开，其中BOTOX还登上了2017年1月16日时代杂志的封面。
BOTOX实际是A型肉毒杆菌毒素，其活性成分为BoNT/A复合物，分子量约为900kDa，由一个神经毒素分子、一个非毒素非凝集素蛋白和血红蛋白凝集素(HA)蛋白构成。这是一种神经毒剂，可以抑制运动神保妥适经冲动的传递，而使局部肌肉不能收缩或是肌肉张力下降。1989年，A型肉毒杆菌毒素正式注册为商品，商标为“BOTOX”，并被美国食品药品管理局(FDA)核准用于12岁以上的肌肉张力性疾病，如斜视，眼肌痉挛等的治疗，近几年才被用于美容整形，主要是治疗面部皱纹。BOTOX注入产生皱纹的肌肉内，会阻断神经递质乙酰胆碱的释放，从而使肌肉张力下降或是肌肉瘫痪麻痹，皱纹也随之而逐渐消失，皱纹去除效果颇佳，特别是对额纹(抬头纹)、眉间纹、鱼尾纹，且操作简单，几乎无痛苦，无肿胀瘀血，见效快，不发生过敏反应等，故这种除皱方法推出后，被许多求美者所接受。
BOTOX发现及FDA批准历程
在Alan Scott(艾伦.斯考特)教授先驱性地将A型肉毒毒素应用于治疗斜视和眼睑痉挛的实验后，艾尔建公司获得了他的授权技术并使该产品通过了FDA批准，用于一系列治疗及美容适应症：1989年获批用于治疗眼睑痉挛和斜视；2002年获批用于治疗中度至重度眉间纹；2013年获批用于治疗眼外眦皱纹(鱼尾纹)。2016年，FDA批准了BOTOX用于治疗成人患者的下肢痉挛。这是FDA批准的第一种也是唯一一种肉毒杆菌毒素产品，用于治疗上肢(肘部、腕部、手指和拇指)和下肢可能受到痉挛影响的多个肌肉群。另外，近些年BOTOX还获批用于上肢痉挛、慢性偏头疼、神经性尿失禁、膀胱过度活动综合征等多种适应症。全球范围内，保妥适在过去的20年中已获83个国家的批准，被用于27种不同的适应症。BOTOX是一座名副其实的超级“金矿”，而且从目前看来，这座金矿似乎丝毫未现枯竭之态。
缩略词：
BoNT：botulinum neurotoxins
CNS：central nervous system
HSA：human serum albumin
HC：carboxy-terminal partof heavy chain
HC-C：C-terminal part ofthe HC domain
HC-N：N-terminal part of HC
HN：amino-terminal partof heavy chain
L：light chain
PSG：polysialoganglioside
PTC：progenitor toxin complexes
SV：synaptic vesicle
VAMP：vesicle-associated membrane protein
SNARE：soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor
参考文献：
1.AbobotulinumtoxinA:A 25-Year History. Aesthet Surg J. 2017 May 1；37(suppl_1):S4-S11. doi: 10.1093/asj/sjw284.
2.https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin
3.Botulinum Neurotoxins: Biology，Pharmacology，and Toxicology. Pharmacol Rev. 2017 Apr；69(2): 200–235.
4.Currentand potential urological applications of botulinum toxin A. Nat Rev Urol. 2015Sep；12(9):519-33. doi:10.1038/nrurol.2015.193.
5. http://www.botox.com/
声明：
本文由药渡头条投稿作者撰写，观点仅代表作者本人，不代表药渡头条立场，欢迎交流补充。联系方式：010-82826195 转8048
如需转载，请务必注明文章作者和来源
投稿详情请点击“9-10月 | 王牌写手获奖名单”