工艺放大参数单一因素及其交互作用对细胞生长和关键质量的影响

摘要

工艺放大时，不仅要考虑单一参数的影响，参数间相互作用对细胞培养的影响对工艺放大也很重要，同时其关键质量参数(CQAs)之间关系也需要探究。文章通过DOE实验研究方法，对放大过程中pH，pO2和pCO2的交互作用对细胞表现、代谢参数和CQAs及蛋白质量的影响进行了实验研究。实验中采用一种新的控制策略，用以控制每个单独的参数，这一控制策略不仅可以测定单一参数的影响，还可以对参数间交互作用的影响进行研究。

单一因素中，多种单抗的电质异荷体受pH和pCO2的影响；N端糖基化分析中，唾液酸化和高甘露糖化与pH成正比。研究揭示了pH和pCO2间的相互作用对单抗电质异荷体和N端糖基化的影响。研究得出，工艺放大时单一参数及多个因素间交互作用均需要进行考量。

背景介绍

CHO细胞，哺乳动物细胞培养中用途最广的细胞系。GMP认证中对细胞高能量筛选和Fed-batch培养明确规定，对CHO细胞主要表达体系的认知一直很重要。加深对CHO细胞代谢以及过程参数交互作用的理解，不仅对工艺优化及工艺放大至关重要，同时也是FDA中QbD的要求。工艺放大过程中，与开发阶段相比pH，pO2和pCO2通常会发生变化，从而造成蛋白异质性(生化性质、免疫原性等)，因此，参数间交互作用对工艺放大尤为重要。

很多文献中报道，过程参数(pH，pO2和pCO2)对CHO细胞代谢和关键质量具有很大影响。Trummer在CHO细胞发酵EPO-Fc时，发现培养温度和pH对细胞代谢、生长和产品质量有很大影响。pCO2同样对细胞生长、产品产量及质量影响很大。文献中针对单个参数的研究较多，但对参数交互作用的研究则很少。

本文献中，运用中心复合实验方法，对pH，pO2和pCO2进行分离控制的新型策略，并对产品质量(电荷、分子量和糖型异质性)进行分析，在体系中研究单个或多个参数对细胞代谢及产品质量的影响。

材料与方法

实验设计与数据分析

采用中心复合实验设计，各参数的范围为对pH6.8-7.2，pO2 10-40%，pCO2 5-20%(37-150mmHg) (Table1)。pCO2设定区间的设定根据生理值及大规模发酵可能值，pH是根据生理值及允许发酵的值，DO的上限按工厂设定为40%。实验过程中，由于pH电极的问题，去除了pH7.2，pO2 40%，pCO2 20%实验组。并且实验组pH7，pO2 25%，pCO2 20%和pH7，pO2 10%，pCO2 12.5%，因其异常蛋白高聚体率，数据分析中除去其质量数据。实验设计与数据分析采用软件MODDE执行。

图片来源于参考文献，下同

细胞株，种子扩培，批发酵

发酵前，在pCO2 10%，温度37℃条件下进行预培养。之后以3*105cells/mL转接3L反应器中，培养温度为37℃。

对pH，pO2和pCO2进行新型分离控制策略，通常情况下，pH控制中使用pCO2进行酸调节；新控制策略中，由于需要分离pH和pCO2控制，pH控制采用HCL和NaOH进行调节。pCO2离线控制，pH和pO2在线控制。

过程监控，单抗、氨基酸测定

每12h取样，测定细胞密度和活率、Osmo、Gluc、Gln、Lac、NH4+、Titer、氨基酸。

产品质量分析

对收获样品测定，电质异荷体(阳离子交换)、聚体(排阻色谱)和N端糖基化分析。

底物比消耗速率/产物比生产速率计算，糖基化水平

比生长速率µ值计算：

VCD-活细胞密度；IVCD-活细胞密度对时间的积分。

底物比消耗速率/产物比生产速率q：

C-产物生成/底物消耗浓度。        

半乳糖(G1)比例，唾液酸(S1)和岩藻糖(aF1)计算类似：

结果与讨论

实验过程中对其他没有控制的因素也进行了考虑，如Osmo、平均细胞活率和培养时间等。Osmo对µ和q值没有明显的影响，培养时间和平均细胞密度与pH相关性很大，但与pO2、pCO2没有关系。pH可引起培养时间及平均细胞密度变化，进而对产品质量造成影响。

对细胞密度与活率的影响

当pH为7.0时，活细胞密度达到最高(VCD)，见Fig.1a。C源不足时，VCD都会降至75%以下，因此，VCD不仅受过程参数的影响，更重要的是营养物质不同。葡萄糖浓度不足时，VCD下降很快。pH从7.0降至6.8，VCD有一定的下降，可能是因为谷氨酰胺不足造成的(Fig.1b,2a/b)。

单一pH，pO2和pCO2以及pH和pCO2交互作用对细胞生长µmax和µaverage的影响进行了监测(Table2)，µmax和µaverage受培养条件影响很大。Table2表明，pH值对细胞生长影响最大，一定范围内pH越高，VCD越高；pCO2对细胞生长有负效果；pH和pCO2交互作用会影响细胞的比生长速率。

对细胞代谢及生产力的影响

CHO细胞代谢对C源和能源(葡萄糖、谷氨酰胺)的依赖性强，并且由于乳酸和铵离子对细胞生理表征影响很大，从而导致副产物积累量较高。此外，氨基酸作为最重要的培养基成分之一，会影响细胞生长和蛋白表达。

如Table2所示，qgluc对pH较敏感(底点为高点的60%)，对pO2和pCO2不敏感。

虽然数据没显示，但pH，pO2和pCO2对谷氨酰胺吸收速率影响不大。与实验结果不同的是，Trummer发现pH越高，消耗越快。但本研究中发现，pH高时谷氨酰胺耗尽所需时间短(Fig.2)，两个研究的差异性可能是由于VCD不同产生的。

qlac受过程参数影响较大(Fig.2)，与低pH值相比，高pH值时lac生成更多，关于这点其他文献中也有报道。另外，Gluc向Lac的转化也受pH的影响，高pH值意味着高转化率。同时，pO2和pCO2对qlac的影响不明显。

pH、pO2和pCO2对铵离子没有明显影响。这点与Yoon的研究一致，但在Trummer的研究中发现铵离子的合成与pH具有一定关系，谷氨酰胺和铵离子代谢的不同可能意味其依赖于细胞系更甚于葡萄糖和乳酸代谢。

pH为7.2时，培养初期由于高细胞密度及高Gluc消耗速率，体系成为Gluc依赖体系(Fig.2a)。pH7.0时，铵表现在合成与消耗间变化(Fig.2c)。pH6.8时，由于铵没有被消耗，因此后期铵积累较多。与Li的研究类似，pH7.0和6.8实验组中，乳酸消耗期间乳酸浓度太低，从而导致丙氨酸消耗，后期铵增加。

实验中共测定了19种氨基酸的深度变化，表3中列举了培养期间9种氨基酸的比消耗/生成情况，高pH值会导致氨基酸(Ser，Asp，Val，Ile，Arg，His)消耗增加。同时，pO2和pCO2对氨基酸的消耗有显著影响，且9种氨基酸中有7种受参数间交互作用影响。实验过程中检测的19种氨基酸可以分为三组，仅消耗组(Arg，Val，Phe，Iso，Leu，Pro，Asn，Ser，His，Tyr，Lys，Trp，Met)，仅生成组(Gly，Cys，Glu)，即消耗又生成组(Asp，Ala)。

实验发现培养过程参数对IgG平均比生成速率具有显著影响，其最低值仅为最高值的30%。Table2数据表明，pH对qp的影响很大，高pH值导致高qp，但Trummer和Yoon的研究中没有发现pH与qp的关系，可能是细胞株不同导致的。虽然Trummer发现pO2和qp间没有关系，但我们实验中发现pO2对qp具有正效应。正如Gray的研究，我们也发现pCO2的最佳值为76mmHg。pH和pCO2间的交互作用对qp具有正效应。从培养各阶段的Titer数据可知，Titer和VCD正相关，当pH为7.0和6.8时产量最高，且pH为7.0时实验设计空间最大(Fig.3)。

对关键质量CQAs的影响

SEC-聚体

抗体在生产和储存过程会形成聚体或产生片段而使其分子量不同，进而影响抗体的免疫原性、效力和药代动力学，所以对抗体的稳定性和结构特征分析时都会涉及到SEC。

数据分析表明，pH、pO2和pCO2对抗体聚体和片段没有影响。但Jing的研究中发现，当DO从50%降至15%时，聚体明显增加。实验中的pH值与抗体的等电点相差较多，因此蛋白的溶解性较好。与Gomes和Hiller相比，本次DOE实验组中蛋白聚体的情形都一样，这可能是因为蛋白聚体的形成与抗体本身有很大关系。

CEX-电荷异质性

电荷分析作为抗体表征的分析工具之一，是由于其对蛋白构象、分子量、序列、糖基化和翻译后修饰的敏感性决定的。实验中，测定了18种不同的电荷分布，并将其分为6组(i)-(vi)，见Fig.4，Table4。

(i) 酸性电荷导质体1(一条轻链上天冬酰胺，经过脱酰胺基作用变成天冬氨酸)受pH影响很大(Table4)。细胞发酵过程中，脱酰胺基作用是不可避免的。脱酰胺基作用最终使蛋白异质性发生，进而影响蛋白结晶化、稳定性及效用。实验组中脱酰胺基化差异性较大，且当pH为6.8时脱酰胺基化最明显(Fig.4)，低pH可提高脱酰胺基作用。

(ii) 酸性电荷导质体2随pH降低而减少(Gig.4；Table4)，同时pH和pCO2交互作用对其影响较大。

(iii) 碱性电荷导质体1，重链上Asp的异构化(与脱酰胺基化属于同一类)，Asp的异构化自发发生于培养基中。实验表明，pH值对Asp异构化影响很大，表现为低pH值，高异构化(Gig.4；Table4)。与Asn的脱酰胺基化一样，Asp的异构化对抗体修饰两等重要。

(iv，v) 碱性电荷导质体2，一条重链上的赖氨酸残基，受pH影响明显(Gig.4；Table4)。碱性电荷导质体3，两条重链上的赖氨酸残基，受pH影响影响明显，两者负相关(Gig.4；Table4)。对于碱性电荷导质体2，降低pH时赖氨酸残基量减少，而碱性电荷导质体3则刚好相反。C端赖氨酸残基在抗体中很常见，细胞溶解后羧肽酶的释放被认为是赖氨酸异质性的原因。pH为6.8时，细胞活率降低及延长培养时间应该造成赖氨酸残基增加，有意思的是，这只符合碱性电荷导质体2，而对碱性电荷导质体3则相反。

(vi) 碱性电荷导质体4与pH值负相关(Gig.4；Table4)。

N端糖基化修饰

理想药物的恰当糖基化修饰是最重要的，因为其可以影响产品的稳定性、效应因子、免疫原性和药代动力学。从21种糖基化模式中选出一种模型进行计算研究，即bG1FSA_2(N-乙酰葡萄糖氨基、半乳糖基化、唾液酸化、岩藻糖化)，单一pH及pH和pCO2交互作用对bG1FSA_2影响显著。与Zanghi研究结果一致，提高DO及pH值可以降低唾液酸化。大约由bG0F(唾液酸化、岩藻糖化)和bG1F(唾液酸化、半乳糖化、岩藻糖化)组成的75%的糖基化对培养条件的变化不敏感。所有实验组中，半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖化(G1、S1、aF1)在一定范围内变化，G1 25-30%，S1 0.5-1.5%和aF1 4-8%。

唾液酸化、半乳糖化、岩藻糖化均受过程参数变化的影响(Fig.5)。pH为7.2时，S1水平最高，另当pO2最高达到40%没有发现最低水平的S1，Ivarsson发现唾液酸化与pH正相关。唾液酸化与M8具有相关性，而与M6没有(Fig.5c)。当pH分别为6.8和7.2时，M6和M8分别最高(Fig.5d)。影响半乳糖化的因素很多，如底物浓度、培养基成分、副产物累积、温度、细胞活率和剪切力。文献中对于过程参数对半乳糖有影响意见不一，但均认为细胞株、产物和培养环境对半乳糖的影响很大。Ivarsson发现，与DO 50%相比，DO为10%和90%时，半乳糖化有少量增加；当pH在6.8和7.2之间增加时，半乳糖化和唾液酸化有少量增加。Table5是过程量对关键因变量的影响总结。

结论

pH对细胞比生长速率、葡萄糖消耗、乳酸生成、氨基酸代谢和比生成速率具有显著的影响。pO2和pCO2的变化会影响细胞生长及产物比生成速率。氨基酸代谢主要受pH影响，但pO2和pCO2以及它们的交互也会影响氨基酸代谢。

实验中没有发现单抗的聚体和片段情况与pH、pO2和pCO2的关联性。由CEX的结果可知，pH或pCO2对单抗电荷修饰(如天冬酰胺脱酰胺作用和天冬氨酸异构化)的作用是显著的。研究中发现，唾液酸化、半乳糖化和岩藻糖化的变化趋势一致。pH为7.2时，唾液酸化水平最高；当pH分别为6.8和7.2时，M6和M8最高。

pH和pO2间的交互作用会影响细胞比生长速率(µmax，µaverage)及产物比生产速率qp。同时还发现pH与pO2和pCO2间的交互作用会影响氨基酸代谢，pH和pCO2间交互作用会影响单抗的电荷异质性和N端糖基化。

实验研究结果表明，考虑因素间的交互作用对细胞表现、培养过程参数和产品质量是必要的。基于实验结果，培养规模较大时，pH变化主要是由于CO2累积和碱添加产生的，放大时pH的影响显著。培养规模较大时，CO2的累积会降低细胞比生长速率、产品比生产速率及影响氨基酸代谢。实验中，pO2对细胞表现及产品质量影响很小。

参考文献：

Investigation of the interactions of critical scale-upparameters(pH, pO2 and pCO2)on CHO batch performance andcritical quality attributes

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