以FDA批准药物为例，浅谈高通量筛选在抗肿瘤药物开发中的应用(下)
Fig 1. Processes in drug discovery and development
本文接上篇《以FDA批准药物为例，浅谈高通量筛选在抗肿瘤药物开发中的应用(上)》。在过去的20多年里，HTS成为化药开发中小分子苗头化合物发现的主力军。很多FDA批准的化学分子类抗肿瘤药物都可追溯至早起的小分子化合物的筛选。对于药物研发历程而言，从项目的早期发现到最终药物的获批上市，大约需要20年的周期。而HTS是一种高效的确定先导化合物的方式，在现代化药开发过程中的重要性不言而喻。
高通量筛选中心在抗肿瘤药物开发中的作用
美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)是美国癌症研究和资助的主要机构，是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)所属的28个研究所中历史最为悠久的研究所。1937年美国总统罗斯福(Franklin D. Roosevelt)批准国家癌症法案(National Cancer Act)，随后NCI正式成立。NCI主要任务是推动国家癌症研究计划的执行，采用多元化的运作模式，其内容包括相关人员培训、健康资讯传播、拟定探讨癌症致病原因、进行早期诊断和临床治疗的计划以及关注癌症病人的康复等工作。
美国国家癌症研究所于1955年成立了国家癌症化疗服务中心用以评估新型化合物作为癌症化疗药物的潜力；而在1976年该服务中心被合并入DTP (Developmental Therapeutics Program)项目中。很多美国获批上市的化疗药物的发现或研发都曾得到DTP的支持。在上世纪八十年代末期，DTP项目开发出60种人类肿瘤细胞系组成的NCI-60组合用于抗肿瘤药物的开发。DTP同样建立了合成化合物库及纯的天然产物库供中心外的研究人员做抗肿瘤药物评估筛选使用。2005年之前，针对小分子药物开展的高通量筛选以及药物化学研究主要在制药公司中进行。为了促进对靶点相关生物学过程的了解、加速新型药物的研发，美国NIH于2005年提出了分子库项目(Molecular Libraries Program)，由分布于各地的分中心组成，所能提供用于高通量筛选的小分子化合物库接近39万种。从库中所筛选出的活性化合物将通过药物化学进行优化，用以开发高质量的化学探针。为便于说明学术性高通量筛选中心在药物发现中的作用，我们在www.cancer.gov中选取了FDA批准的121种小分子抗肿瘤药物作为分析对象，如图2所示。
Fig 2. Targets of FDA-approved small-molecule cancer drugs organized by approval date
图2中，我们根据FDA批准上市的时间为序，整理了小分子抗肿瘤药物所对应的靶点分类。在1982年之前获得批准的药物中，有超过31%其作用机制为诱导产生DNA损伤。随着时间的推移，该作用机制类型的药物数量逐步减少，而作用于某个特定蛋白靶点的药物数量逐步增加。对于靶向于核酸结合蛋白、细胞骨架蛋白、转录因子及氧化还原酶类分子的药物而言，数量基本保持稳定。与之相对，在过去的20年里，没有任何一种靶向于异构酶或酶调节蛋白的药物获批上市。与之相反，靶向于防御/免疫蛋白、细胞粘附分子、连接酶及信号分子类的药物则在过去的10年里首次获批上市。获批的靶向水解酶类的药物自上世纪九十年代中期以来稳步增长；与此同时在过去的15年里，靶向于包括激酶在内的转移酶类分子及受体分子的药物数量也有了大幅提高。小分子筛选对抗肿瘤药物开发的贡献始于上世纪90年代初而在2000-2015年间表现最为突出。
Fig 3. Bar chart showing the distributions for unique targets of FDA-approved cancer drugs, cancer-relevant HTS assays from PubChem, and chemical probes
为评估此类对公众开放的小分子化合物筛选中心的重要性，我们分析了在筛选过程以及化学探针所对应的肿瘤相关的靶点，如上图所示，其中包含了FDA所批准的小分子抗肿瘤药物的靶点分布。在获批上市药物的靶点中，占比较大的有受体类分子(21%)、核酸结合蛋白(14%)、转移酶(14%)、转录因子(7%)以及氧化还原酶(7%)。表1对上述大类靶点的统计数据进行了进一步的细化，其中涵盖了诸如激酶以及GPCR等分类。在HTS筛选实验中占比较高的靶点有核酸结合蛋白(14%)、转录因子(12%)、受体(9%)、转移酶(9%)以及氧化还原酶类(4%)。与之类似，化学探针所对应的靶点主要分布于受体(13%)、核酸结合蛋白(13%)、转录因子(13%)转移酶(9%)以及氧化还原酶类(5%)。
表1. Classifications for the unique targets of cancer-relevant HTS assays from PubChem (assay targets), chemical probes (probe targets), and FDA-approved small-molecule cancer drugs (drug targets).
转录因子通常被描述为不具有成药性(undruggable)，在公共性药物筛选中心的靶点数量中占据第二位。尽管如此，现有开发出的探针可用来调节12种转录因子类靶点。水解酶是公共性药筛中心的另一大类靶点，占比为12%，其中的18%为磷酸酶，在之前研究中同样被认为不具有成药性。而在目前的筛选中，有两类探针(ML119及ML120)可靶向于蛋白酪氨酸磷酸酶的某些亚型；而ML113则可以靶向于双特异性磷酸酶3。探针ML174则是蛋白磷酸酶甲基酯酶的选择性强效抑制剂，通过翻译后调解方式简介调节PP2A的活性。酶调节分子及信号分子类别在靶点中占比均为7%。尽管靶向于酶调节分子的化学探针有三种，但近20年中没有该类别的药物获得批准上市。而对于信号分子类别靶点，其对应的化学探针目前发现的有8种，但开发出药物的靶点只有一种，所对应的药物分别为vismodegib及sonidegib，用于治疗基底细胞瘤。只有四类靶点较为特殊，目前已有药物获得批准上市而没有相应的化学探针，分别为：细胞骨架蛋白、异构酶、连接酶以及防御/免疫蛋白。
目前在研的蛋白靶点中，尚有9类暂时没有抗肿瘤药物获批上市，分别是：转运蛋白、载体蛋白、钙离子结合蛋白、分子伴侣、裂解酶、膜穿梭蛋白、储藏蛋白、细胞连接蛋白以及细胞外基质蛋白。尽管如此，这其中的转运蛋白、裂解酶以及细胞连接蛋白三类已开发出化学探针。目前研究人员正致力于开发新的化学探针，用于调节新型或未知靶点类别的功能，这将有助于我们进一步理解肿瘤背后的生物学机制，从而为药物开发提供一个起点，同时推动改善具有“成药性”靶点的一些限制性因素。
有两家筛选中心的项目靶向于蛋白-蛋白间相互作用，如图3所示。其中一个项目所开发出的化学探针ML223，可破坏转录因子RunX1同其激活因子CBFβ间的相互作用。蛋白-蛋白间相互作用通常认为对小分子而言不是很理想的靶点，但也有特例存在，如化学探针ML203及ML265的肿瘤抑制活性是通过稳定丙酮酸激酶M2的四聚体亚基间的相互作用而发挥功效。在121种FDA批准的小分子抗肿瘤药物中，有20种从机制上可以归为诱导DNA损伤类型。除此之外，还有些肿瘤相关的小分子筛选作用于细菌性及病毒性靶点(占比3%左右)，并导致了5种化学探针的发现。
Fig 4. Distribution of assay technologies applied to cancer-relevant HTS assays reported in the PubChem database
对PubChem数据库中HTS过程所采用的检测方法分类会发现，基于生化手段的实验与基于细胞的实验各占半壁江山，如图4所示。在用于肿瘤靶点研究的生化检测手段中，常见的基于荧光技术的方法及荧光偏振技术分别占比高达30%及29%。而诸如EMS及NMR等技术虽然占比只有1%及3%，且应用到高通量筛选过程中有些困难，但却能提供一些很有价值的信息。而在基于细胞的检测方法中，荧光素酶报告基因最为常见，占比高达34%；紧随其后的为一些基于发光技术(19%)及荧光(12%)的一些方法。令人感兴趣的是，一些在基础实验中常用，但却不容易开发成高通量筛选手段的实验技术也出现在了这份表单中，如质谱(1%)，western分析(1%)及实时荧光定量PCR(1%)等。
不同筛选策略案例
为更好的阐述小分子筛选策略在抗肿瘤药物开发过程中的应用，我们具体分析两个案例。第一个案例会展示在新发现的肿瘤相关基因突变作为药物靶点发现过程中，生化检测方法及基于靶点的筛选策略的重要性；第二个案例会重点阐释患者来源的原代细胞在表性筛选中的重要性，并强调了其中老药新用的潜力。
案例1：异柠檬酸脱氢酶突变体1/2
Functions of isocitrate dehydrogenase 1 and its mutants
野生型IDH1以同源二聚体的形式存在，在辅因子NADP+存在时催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸。2008到2009年间，不同的小组分别发现在急性骨髓性白血病AML及胶质母细胞瘤标本中携带有杂合的IDH1基因单个氨基酸突变(R132)。进一步的研究发现，超过75%的某些类型脑部肿瘤以及20%的AML患者都携带有IDH1/2突变，并且该突变也发现于其他一些实体瘤中，诸如软骨肉瘤、胆管癌、结直肠癌和前列腺癌等。该基因的突变导致了酶活力的损失，但Agios的科学家们证实该突变也会导致一些新的获得性功能。代谢谱研究发现，IDH1野生型的产物α-酮戊二酸(α-HG)可被突变型IDH1转化为2-羟基戊二酸二乙酯(2-HG)，后者可在IDH1/2突变的肿瘤细胞中累积。2-HG通过影响DNA及组蛋白的甲基化过程等在肿瘤发发生和生长过程中扮演重要角色。作为一类药物靶点，IDH1/2比较适合于个性化药物治疗方案的应用；并且据预测，特异性的靶向于IDH1/2突变体在临床上会产生较少的副作用，因为当用药物阻断IDH1/2突变体功能时，不会破坏体内其他生化过程的进行。由此，IDH1/2突变体成为小分子抑制剂类药物开发的重要候选靶点。
IDH1/2突变体的作用机制被揭示后，迅速成为各制药公司及学术研究中心开发小分子抑制剂药物的热点领域。考虑到IDH1/2处于三羧酸循环过程中，获得IDH1突变体重组蛋白难度相对较小。困难在于该反应为一个新型的生化反应过程，需要开发出适合于HTS过程的检测方法。2012年Agios报道了第一个IDH1突变体抑制剂AG-5198，该化合物采用重组的IDH1 R132H同源二聚体分子开展生化活性高通量筛选而得(细胞中该蛋白最常见的形式为形成野生型/突变体的异源二聚体)，具体过程采用了NADPH相关的偶联酶体系。通过生化检测来评估对野生型IDH1的选择性，以及采用基于细胞的检测手段来监控2-HG水平的降低，最终苗头化合物优化成为先导化合物AG-5198。该化合物可以影响携带有IDH1突变体的胶质母细胞瘤生长，并促进其分化，进一步确认了药物的靶点相关性。类似的药物化学策略及筛选方法也被多家机构采纳，并发现了ML309分子。Agios的研发团队则进一步开发出了IDH1突变体抑制剂AG-120、IDH2突变体抑制剂AG-221及广谱的IDH1/2抑制剂AG-881，后者能够突破血脑屏障。尽管这其中很多化合物的具体结构尚无文献批露，上述三类化合物已在AML及其他一系列实体瘤患者中开展临床研究。从对突变体的第一次报道，到有候选药物分子进入临床研究阶段，时间间隔仅为7年。
Pipeline of Aigos
Enasidenib Mesylate (AG-221)由新基与Agios Pharmaceuticals共同研发，于2017年8月1日获美国FDA批准上市，由新基公司在美国上市销售，商品名为Idhifa®。2014年，该化合物因急性骨髓性白血病获得美国孤儿药资格。同年，获得美国快速通道资格，于2017年1月向美国提交上市申请，用于治疗急性骨髓性白血病。
与此同时，其他一些制药公司也针对该类别酶分子靶点开展了药物筛选工作，如赛诺菲以及葛兰素史克等采用类似的筛选策略，所使用的野生型/突变体的异源二聚体为最常见的R132C及R132H用于筛选过程。在每一个项目中，研究人员均在追求不同的化学骨架，并且胞内活性通过检测药物对2-HG的产生情况的影响进行评估。Agios也在采用类似方式开展IDH2突变体抑制剂AGI-6780的研究。
案例2：利用患者来源的原代细胞开展老药新用开发
Workflow for the NPC library construction process
小分子高通量筛选技术的应用还包括老药新用的开发，以及拓展现有获批上市药物的新适应症。出于此目的，NCGC Pharmaceutical Collection整合了大约2800种临床获批或具有药物活性的小分子，包括FDA批准用于人体或动物应用的药物、其他国家批准的用于人体应用的药物以及出于临床研究阶段的药物。近期采用该策略比较成供的案例是在该药物库中确定了数种候选药物用于CLL的治疗。
目前临床上对于治疗CLL的新型药物十分迫切，缘于现有治疗方案往往不能治愈，并且在经过现有化疗药物治疗后容易复发。一项基于发光技术的细胞活性检测实验被用于比较库中化合物对来源于六位患者的CLL细胞及正常捐献者细胞毒性的差异。这种表型检测方法有效的覆盖了很多的分子靶点或作用机制，并且重点在于揭示了白血病与正常细胞敏感性差异之间的治疗窗口。通过比较不同药物对六位患者CLL细胞的不同反应，可以确定最佳的候选化合物。分析最敏感的患者细胞的反应，我们会得到356种活性化合物，占比13%；而对于最不敏感的受试细胞，活性化合物有117种，占比为4%。另外，在所有的对6种细胞均具有活性的化合物种，其活性也存在较大差异；最为显著的例子为vinblastine，在两株不同的CLL细胞中其效果差异超过100倍。
附注：
Different purposes and requirements for chemical probes and drugs
缩略词表：
AM：acute myeloid leukemia
CLL：chronic lymphocytic leukemia
DTP：Developmental Therapeutics Program
FDA：Food and Drug Administration
HTS：high-throughput screening
IDH：isocitrate dehydrogenase
MIPDD：mechanism-informed phenotypic drug discovery
NCI：National Cancer Institute
PARP：poly(ADP-ribose) polymerase
PDX：patient-derived tumor xenograft
PPI：protein–protein interaction
IP：intellectual property
MoA：mechanism of action
MW：molecular weight
IDH：isocitrate dehydrogenase
参考文献：
1. The NCI60human tumour cell line anticancer drug screen. Nat Rev Cancer. 2006Oct;6(10):813-23.
2. Targetdeconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology anddrug discovery. Arch Pharm Res. 2015 Sep;38(9):1627-41. doi:10.1007/s12272-015-0618-3.
3. DrugDiscovery by Molecular Imaging and Monitoring Therapy Response in Lymphoma. IntJ Mol Sci. 2017 Jul 27;18(8). pii: E1639. doi: 10.3390/ijms18081639.
4. Small-MoleculeScreens: A Gateway to Cancer Therapeutic Agents with Case Studies of Food andDrug Administration-Approved Drugs. Pharmacol Rev. 2017 Oct;69(4):479-496. doi:10.1124/pr.117.013755.
5. Thepromise and peril of chemical probes. Nat Chem Biol. 2015 Aug;11(8):536-41.doi: 10.1038/nchembio.1867.
6. Targetidentification for biologically active small molecules using chemical biologyapproaches. Arch Pharm Res. 2016 Sep;39(9):1193-201. doi:10.1007/s12272-016-0791-z.
7. Principlesof early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar;162(6):1239-49. doi: 10.1111/j.1476-5381.2010.01127.x.
8. Targetclass drug discovery. Nat Chem Biol. 2017 Sep 19;13(10):1053-1056. doi:10.1038/nchembio.2473.
9. dtp.cancer.gov
10. IsocitrateDehydrogenase 1 and 2 Mutations in Cancer: Alterations at a Crossroads ofCellular Metabolism. Journal of the National Cancer Institute, Volume 102,Issue 13, 7 July 2010, Pages 932–941, https://doi.org/10.1093/jnci/djq187
11. The NCGCpharmaceutical collection: a comprehensive resource of clinically approveddrugs enabling repurposing and chemical genomics. Sci Transl Med. 2011 Apr27;3(80):80ps16. doi: 10.1126/scitranslmed.3001862.
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