工艺从小试到放大时kLa和kLaCO2分别是如何变化的，为什么？
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细胞培养的小试工艺确定后，如何保证规模扩大后细胞生长、产品产量及质量的稳定性是一个新的考验。简单的说，工艺放大主要是保证细胞所处环境一致，其中良好的传质是个重要的先决条件。为保证放大后传质效果一样，细胞培养工艺从小试转移到中试甚至生产时，常依据一些参数进行放大，如P/V、Mixing time、kLa和kLaCO2等。
在上面提到的四个因素中，kLa和kLaCO2分别为体系中O2和CO2的传质系数，即两者的传质效果。kLa，表征氧气从气相进入到液相的速率，但由于氧气在水中的低溶解度，氧气传质速率(OTR)一直是好氧微生物培养的重要参数。反应器中合适的kLa是工艺放大的关键，O2作为细胞的重要营养物质，影响细胞的正常生长及代谢，工业生产中一般将O2浓度控制在40%。
细胞培养过程中体系中会积累CO2，其主要来源于葡萄糖及氨基酸代谢，通常用pCO2 (mmHg)表示体系中CO2的累积量。不同细胞系的最佳pCO2均不同，当体系中CO2累积增加导致pCO2升高时不仅对细胞生长和蛋白产生影响，而且还会影响蛋白的质量如糖基化水平等。对此不同的学者均有研究，Gray等观察到高水平的pCO2 (>105 mmHg)会对细胞生长及蛋白产量产生抑制；Kimura等就36-250 mmHg的pCO2对MT2-1-8 CHO细胞生长进行了研究，发现250 mmHg的pCO2下细胞的比生长速率降低了30%；Matthias Brunner等在研究pH，pO2和pCO2对细胞生长和关键质量的影响中发现，pH和pCO2交互作用对N-乙酰葡萄糖氨基、半乳糖基化、唾液酸化、岩藻糖化的影响显著，pCO2对单抗电荷修饰(如天冬酰胺脱酰胺作用和天冬氨酸异构化)的影响显著的。由此可知，如何避免体系中CO2的累积，工艺开发时如何移除CO2就需要着重进行考虑。与kLa类似，kLaCO2 (CO2的传质系数)可以用来表征体系中CO2的移除能力。
工艺开发阶段体系中kLa和kLaCO2均可以达到要求，二者可以说是步调一致，但是随着培养规模的扩大情形就有所改变。Naoki Matsunaga的团队研究了不同培养规模反应器(80L，500L，2000L和10,000L)的O2供给与CO2移除能力，即kLa和kLaCO2，结果如下图。
不同规模反应器中、不同VVM以及不同搅拌桨线速度时的kLa和kLaCO2(图表来源参考文献1)
从上图中的FIG.4可以得出，随着培养规模的扩大，kLa的呈增加的趋势。同样条件下，kLaCO2虽然也有所增加，但是没有kLa增加的程度大，见上图FIG.5。除上面测的kLa值外，观察培养过程中O2的消耗也可以看出kLa是随工艺放大的增加，见下表。表中80L、500L和2000L的细胞接种密度一致，均为2.0*105 cells/mL，DO控制也一致，且培养过程中细胞生长曲线类似。在其他条件相似的情况下，放大过程中耗氧量反而下降，从647L降低至297L，这表明随培养规模的放大O2的传质能力增加，即kLa随培养规模增加而增加。
图表来源参考文献1
既然Naoki Matsunaga的研究表明，工艺从小试向中试转移或从中试向生产转移过程中，kLa和kLaCO2均是增加的。那么工艺放大时可以不用考虑O2供给与CO2移除吗，尽可放心的进行放大？实则不然。
虽然kLa和kLaCO2均是增加的，但是二者增加的比例是不同的，并且不同规模下kLa相同时kLaCO2也有较大区别。如果将上面的FIG.4和FIG.5中的b图拿出来进行比较，就不难发现这点。
搅拌线速度相同时不同规模下的kLa和kLaCO2比较(图表来源参考文献1)
在上图中，对相同的通气条件下(vvm相同)500L和2000L的kLa和kLaCO2进行比较。反应器规模为500L时，其kLa为0.7h-1，而kLaCO2为0.3h-1；反应器规模为2000 L时，其kLa为0.7h-1，而kLaCO2为0.2h-1；即同等条件下，kLa和kLaCO2的差别较大，kLaCO2还不能达到kLa的一半。而且，当反应器规模不同时(500 L、2000 L)，kLa为0.7h-1时，500 L的kLaCO2为0.3h-1，2000L的kLaCO2为0.2h-1；即在放大时维持kLa相同时，kLaCO2也是随着反应器规模扩大而降低的。
是什么原因造成了放大时kLa增加，kLaCO2反而降低？可以从下面的模型中进行简单理解，其中相关的数据并不准确。向反应器中通入纯氧时，气泡在上升过程中与培养基发生传质，气泡中的氧含量不断降低。反应器规模越大，气泡在培养基中的停留时间越长，则更多的氧气从气泡中进入培养基，气泡的含氧量就越低，即反应器规模扩大时kLa会增加。
与O2相反的是，CO2的移除是从培养基中进入气泡中，其传质方向不同。同样的底部通气策略时(相同的vvm)，由于大反应器中的氧气需求降低(反应器从80L到2000L，需氧量从647L降低至297L)，没有同等比例的气泡将反应器中多余的CO2移除。并且，气泡上升过程中CO2不是一直从液相传质到气相的，其分为两个阶段：传质和平衡，最终气泡中的CO2是一定的，不会随着高度而增加。反应器规模扩大时kLaCO2反而降低。
由此可以得出，工艺放大时kLa会增加，kLaCO2反而降低。与小试相比，反应器放大时低kLaCO2导致CO2累积增加，pCO2增加。如下图所示，5L、20L和5000L中的CO2含量随着培养规模增加而增加。
图表来源参考文献2
CO2过量累积对细胞生长及蛋白质量均有不利影响，如何增加体系中的CO2的移除率，可以从反应器放大中缺失的通氧量入手。Naoki Matsunaga的研究中对不同vvm时的kLaCO2进行了测定，实验表明增加vvm可以增加kLaCO2，即提高vvm可以加快移除CO2，从而控制体系的CO2含量在可授受范围内。值得注意的是提高vvm时会伴随着体系中泡沫数量，所以此时还应将泡沫情况考虑在内。
不同vvm时的kLaCO2值(图表来源参考文献1)
参考文献：
1. Culturescale-up studies as seen from the viewpoint of oxygen supply and dissolved carbondioxide stripping；
2. Scale-UpAnalysis for a CHO Cell Culture Process in Large-Scale Bioreactors；
3. BioreactorScale-Up and Oxygen Transfer Rate in Microbial Processes: An Overview。
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