单抗电荷异质性知多少
与其他蛋白一样，单克隆抗体具有许多翻译后修饰，如末端的改变、糖基化、脱酰氨基作用、异构化、氧化、分裂、聚合等。几乎所有的这些修饰都会引起单抗表面电荷的改变，直接的(改变电荷集团数目)或间接的(引起构象改变)，这就是单抗的电荷异质性。
基于单抗所带电荷可对其进行分离，进而可对电荷异质体进行分析，常用的分析方法有等电聚焦凝胶电泳(IEF)、毛细管等电聚焦凝胶电泳(cIEF)、阳离子交换色谱法(CEX)和阴离子交换色谱法(AEX)。与主峰相比，这些变异体通常被称为酸性变异体和碱性变异体，即酸峰和碱峰。采用CEX分析时，酸峰早于主峰洗脱出来，而碱峰晚于主峰洗脱出来，如图1所示。
图1 酸峰、主峰和碱峰的CEX图谱
(图片来源于参考文献3)
酸峰和碱峰的来源可分为以下几个方面：N位糖基化、C末端赖氨酸不均一性、氨基酸氧化、天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化、共价加合物和N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化等。
1、N位糖基化
不同水平的唾液酸化被认为是电荷异质体的来源之一，当用CEX和IEF方法进行测定时表现为酸性峰。此外，当糖基化的整个糖链被PNGase F移除时通常会导致两种结果：第一，由于天冬氨酸的暴露而呈现酸峰；第二，因唾液酸被一起移除而呈现碱峰。其次，Fc端的构象会受其糖基化修饰的影响，进而影响到抗体所带的表面电荷。还有报道称，高甘露糖型在CEX检测中表现为酸峰。
高水平的唾液酸化会影响单抗与FcγRIIIa的结合，进而导致ADCC活性的降低。
2、 共价加合物
抗体在生产或储存过程中会与接触的化学物质等发生作用，形成不同类型的共价加合物。主要有三种方式：①抗体上的电荷集团因相互作用而丟失；②小分子与抗体发生作用，聚集在抗体上产生电荷；③由于反应时抗体结构改变产生的电荷。
常见的共价加合物主要有：
a. 无酶介入的糖苷化，当糖(半乳糖等)富裕时无论是在生产、储存、甚至在人血浆中均会发生，且一般会发生于赖氨酸残基上。Andya等研究中发现，当喷雾干燥的样品在30℃储存9个月后，用IEF检测可观察到酸峰的改变，推测这种改变是由过量的半乳糖造成的；
b. 有学者在转基因山羊合成的单抗中发现了马来酸修饰，这种修饰发生于N端的轻链或者重链中，且在CEX中发现为酸峰；
c. 当单抗被储存在含有硫代硫酸钠的缓冲液中时，单抗与硫代硫酸盐形成加合物，表现为酸峰；
d. 还有研究发现，当单抗在柠檬酸和琥珀酸的缓冲液中孵化时会导致酸峰的增加，质谱显示这是由于单抗与柠檬酸和琥珀酸发生反应造成的。
3、氧化
蛋白的氧化是比较常见的，且通常会影响到蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸和色氨酸等。对于IgG1单抗，报道最多的是蛋氨酸残基氧化成蛋氨酸亚砜，其发生于CH2区域的M252位及CH3区域的M428位的蛋氨酸残基，表现为碱峰，且叔丁基化过氧氢(tBHP)、H2O2、紫外均可成为蛋氨酸氧化的诱因。此外，重链上CDR3区域的色氨酸残基的氧化也有报道。
从单抗的三级结构来讲，M252和M428位于CH2和CH3的交接处，靠近FcRn结合位点，但还没有研究表明这两个残基对于FcRn结合具有关键作用，且M252和M428的氧化对FcRn结合的影响也还没有确定。
4、C末端赖氨酸不均一性
IgG类单抗C末端的重链上均存在赖氨酸残基修饰，正常情况下可以被羧肽酶切除。然而，这种切除是不完全的，通常会导致一条重链或两条重链上还有赖氨酸残基修饰。而当细胞内的羧肽酶水平较高时，两条重链上则没有赖氨酸残基修饰。这便是C末端赖氨酸不均一性，也称为k0、k1、k2。
C末端赖氨酸不均一性可以采用CEX和IEF的方法进行测定，由于赖氨酸胺的存在表现为碱峰。如果需要将赖氨酸移除，选择羧肽酶B (CPB)会是一个快速的方法。值得一提的是，C末端赖氨酸不均一性不会影响单抗的效能及安全性，但是C末端赖氨酸不均一性依然是评价单抗的参考。
5、N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化
N末端谷氨酰胺(Q)及谷氨酸(E)环化形成焦谷氨酸盐(pE)也会造成单抗电荷异质性，其作用机制如图2所示。一般认为，环化酶会介入到pE的形成中，但纯化后的单抗在储存过程中也有发现环化的发生，即Q及E环化不论环化酶存在与否均会发生，这是一种自发过程。
在CEX检测中Q环化表现为酸峰，而E环化则是中性的，这是因为在谷氨酸环化时各产生一个酸性和碱性集团。与C末端赖氨酸不均一性类似，N末端谷氨酰胺及谷氨酸环化对单抗的效能及安全性没有影响。
图2 N末端谷氨酰胺(Q)及谷氨酸(E)环化形成焦谷氨酸盐(pE)
(图片来源于参考文献1)
6、天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化
除去上面提到的可自发发生的反应外，温和条件下自发进行的天冬酰胺(N)脱酰胺化和天冬氨酸(D)异构化也是单抗电荷异质体的重要组成。如图3所示，这两种反应都会形成一种共同的中间产物——琥珀酰亚胺，之后再水解成3:1的异构天冬氨酸(isoD)和天冬氨酸(D)。天冬氨酸异构化不会改变单抗的电荷，但会影响单抗的结构，而天冬酰胺脱酰胺化通常被报道为酸峰。
图3 天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化机制
(图片来源于参考文献1)
天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化的速率取决于众多原因，主要有氨基酸序列、高阶结构和pH。C末端天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化与其连接的氨基酸有关，当与甘氨酸连接时速率最大，其次为组氨酸和丝氨酸。单抗天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化是始终存在的，事实上其比由单抗本身半衰期造成的影响还要大，合适的发酵条件和储存温度是降低天冬酰胺脱酰胺化及天冬氨酸异构化的主要方式。
天冬酰胺脱酰胺化会导致1 Da的质量增加，酶降解后可采用质谱进行测定，但酶降解过程可能会引进新的片段，降解方法需经过优化后才能保证得到良好的结果。而天冬氨酸异构化的测定则更具挑战，异构化不会产生质量变化。但如果在琥珀酰亚胺水解时，加入重氧分子(18O)则可以检测到。此外，含有N、D和isoD的多肽采用反相色谱也可进行检测，其洗脱顺序为isoD-N-D。
单抗天冬酰胺脱酰胺化的位点主要有两处：CDRs和Fc端的肽段GFYPSDIAVEWESN384GQPEN389NYK，而天冬氨酸异构化的位点还没有明确，但在CDRs已发现有天冬氨酸的异构化，如表1所示。在众多学者的研究中，CDRs区域及N387、N389位的天冬酰胺脱酰胺化对单抗而言形成了酸性峰，但是中间产物琥珀酰亚胺的不完全水解(碱性环境下利于水解)会导致碱峰的产生。
由于易脱酰胺化的两类天冬酰胺均位于CH3区域，而FcRn的结合位点位于CH2和CH3的交接处，FcγR的结合位点位于CH2附近的铰链区，因此天冬酰胺脱酰胺化可能不会影响到单抗的ADCC功能及半衰期，但这点还有待确认。
表1 天冬酰胺脱酰胺化和天冬氨酸异构化位点
(图片来源于参考文献1)
造成单抗电荷异质性的原因是错综复杂的，除去上面提到的因素外，单抗聚体及片段、二硫键及三硫键、丝氨酸突变为精氨酸等都会影响到单抗电荷异质性。电荷异质性的改变，有些会影响单抗效力，有些则不会，但是保证电荷异质性的一致性对单抗的生产同样重要。
参考文献：
1. Heterogeneityof Monoclonal Antibodies Revealed by Charge-Sensitive Methods；
2. Chromatographicanalysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies；
3. Chargevariants in IgG1 Isolation, characterization, in vitro binding properties andpharmacokinetics in rats。
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