关于单抗聚体的那些事
大多数蛋白都有形成聚体的倾向，单抗在生产、储存、运输和注射到病人体内时都会伴随缓慢的聚体形成过程。控制单抗聚体含量，一方面是为降低杂质，提高纯度；另一方面是因为在治疗过程中，聚体的存在不仅会降低药物的效果，还会引起机体的免疫反应，具有潜在的副作用。在动物免疫原性研究的实验中发现，聚体中天然结构比例以及聚体的大小决定其免疫原性的强弱，因此有学者推断，聚体的免疫原性是由其表面的抗原表位的重复性决定的。
聚体的产生是一个复杂的过程，简单来讲就是单体蛋白聚集形成由两个或多个蛋白组成的稳定复合物。其形成过程包括：蛋白天然结构的破坏，形成可逆自聚合；由于构象的改变，使这种可逆的自聚现象变得不可逆转；其他单体加入使聚体变大，聚体与聚体相互作用形成可溶性聚体团，聚体大小再次增加；可溶性聚体团相互分离，导致不溶性聚体产生。
聚体通常是由较强的非共价结合力连接在一起，且需要一定程度的构象改变(错误折叠或者未折叠)呈现出关键氨基酸序列(也称为“hot spots”，具有较强的、可形成不可逆聚体的趋势，为聚体的核心)，由此将不同单体聚集在一起，当然并不是说正确折叠时就不会形成聚体。单抗可以形成不同形式的聚体，如图1所示，其中红色区域表示“hot spots”，蓝色双向箭头表示可逆过程，红色单向箭头表示不可逆过程；单抗的Fab段和Fc段的错误折叠、未折叠及正确折叠均可形成聚体，并且当可溶聚体分裂后便不再溶解。但是，对于蛋白是采取具体哪种方式形成聚体还没有明确的判定方法，也就没有针对的措施，但聚体的含量并不是不可降低的。
图1 单抗形成聚体的路径示意图
(图片来源于参考文献1)
具有形成聚体趋势的氨基酸序列或残基，也就是“hot spots”，其不仅仅只存在蛋白的某一个位置。通常情况下，这段氨基酸序列或残基具有高度疏水性、低电荷性且易形成β-折叠，即促使蛋白正常折叠的作用力恰恰也导致聚体的形成。如果能对氨基酸序列中暴露的“hot spots”进行准确的定位，并对其进行改造，导致蛋白相互间形成斥力，则会影响固有的成聚体倾向。然而，这种基因手段并不一定行得通，因为还没有准确的预测和断定“hot spots”是否真的暴露在蛋白表面，以及是否参与到聚体形成过程中。
对于单抗，对其可变区的补体决定簇(CDRs)的改造，如促进CDRs边缘氨基酸突变、在CDRs附近添加糖苷均可增加聚体形成的阻力。另外，对蛋白电荷的改变也是阻力聚体形成的措施，如通过突变暴露的氨基酸残基、在抗体末端增加带电多肽；有研究指出，带强负电荷的氨基酸(如缩氨酸)的存在，可增强单体间的静电排斥作用力，从而能够抑制聚体的形成。蛋氨酸残基氧化对多种蛋白形成聚体的倾向性具有重要的影响，为达防止蛋氨酸残基的氧化，冷冻通常是抗体储存及运输中的选择，从而可减少聚体的形成。
抗体生产过程中，上游通常决定聚体形成的速度，其所处环境如温度、蛋白浓度、pH和离子强度均会影响聚体数量。在一项关于聚体的研究中，采用SEC方法测定聚体含量，其实验结果下图2。在D3-D13天中，随着抗体浓度的增加，聚体含量呈线性增加；在D13天，将细胞从培养基中去除，收获的包含抗体的培养液在37℃下孵育两周，发现聚体含量还在缓慢增加，即使抗体浓度没有变化，孵育时间越长，聚体含量越高；这项研究表明，可通过减少培养时 49 30569 49 15231 0 0 2259 0 0:00:13 0:00:06 0:00:07 2688 49 30569 49 15231 0 0 2078 0 0:00:14 0:00:07 0:00:07 2900间来降低聚体含量。
图2 细胞培养过程中聚体含量变化
(图片来源于参考文献2)
抗体所处的溶液环境、与容器的吸附作用及化学降解过程均会影响中间体的浓度，以及它们的相互作用，通过对溶解环境的改变可降低聚体形成速率及含量。例如，对pH(调整pH使其远离蛋白的等电点pI)和离子强度的调节，可以增加聚体成长的难度，如图3；对pH和离子强度的调节可改变抗体所带电荷，从而单体间的静电排斥作用力得以增加，用以抵消“hot spots”间的强疏水作用力，抑制聚体的形成；一般认为，负电荷增加的效果较正电荷要更明显些；这项研究已经适用于多种聚体体系，如单抗、细胞因子、球蛋白等。
图3 抗体电荷对聚体成长的影响
(图片来源于参考文献1)
此外，二硫键也被认为是聚体形成的因素(二硫键可增加β-折叠)，二硫键的正常连接是蛋白正常折叠的条件之一。硫醇基是二硫键的重要来源，半胱氨酸上未进行结合的自由硫醇基会导致二硫键含量的减少，进而蛋白发生错误折叠。二硫键的形成需要一定氧化环境，因此氧化剂Gu2+的添加可促进二硫键的形成。另外，自由硫醇基会影响抗体的长期稳定性，对自由硫醇基的去除可增加抗体的稳定性。
对于上游不能控制的聚体，下游则但任去除聚体的角色，纯化过程中将会使用的各种各样的缓冲液是影响聚体含量的重要因素。Protein A洗脱抗体时使用的酸性缓冲液会导致聚体的形成；研究发现，与柠檬酸盐、甘氨酸及组氨酸相比，此步骤的缓冲液中精氨酸的加入可降低收获液中聚体的含量。多筛口的SEC柱分析可根据单体与聚体的大小不同，而将聚体去除，但会牺牲部分回收率。AEX和CEX降低聚体率的机理主要在于其可将二聚体或多聚体分解成单体，最优条件下的聚体含量可降至0.5%以下。而UF/DF阶段的频繁过滤及缓冲液更换，其机械压力可能会导致蛋白聚体的增加；但是与SEC原理相同，超滤也可用于聚体的去除。
抗体聚体的控制不仅可在生产及储存过程中实现，药物研发初期也可进行初筛，如①在高温条件下进行实验，从众多蛋白中筛选出最不易发生错误折叠及聚体的蛋白；②寻找与目标蛋白类似的来源不同的蛋白(天然能够抑制聚体形成)，并就两者结构与序列进行比较，筛选出不易聚集的蛋白。
参考来源：
1.Therapeutic Protein Aggregation: Mechanisms, Design, and Control；
2.Protein Aggregation and Bioprocessing；
3.When GoodGoes Awry: The Aggregation of Protein Therapeutics。
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