单抗糖基化调控之参数篇(下)

关键质量参数是单抗仿制药研发的标杆，包括糖基化修饰、聚体、电荷异质性等，其中如糖基化修饰对单抗的生物活性、免疫原性、药物代谢动力学、构象、稳定性及溶解度具有重要的影响。细胞培养过程中细胞所处环境，如pH、温度、渗透压、溶氧等参数会影响到单抗糖基化表现，本文从pH着手就文献中不同pH设置及调节pH时的pCO₂水平和不同的碱液对糖基化影响的研究进行了简要总结。

pH是细胞培养过程中重要的参数之一，其对细胞生长、蛋白生产及蛋白质量有不容忽视的作用，CO₂作为pH调节控制的重要组成部分近年来也慢慢引起了研究人员的重视，血气分析仪在细胞培养中的普遍使用也为研究CO₂对细胞表现的影响带来便利。

Brunner的团队通过新型分离控制策略在CHO细胞中研究了单因素pH(6.8、7.0和7.2)、pCO₂(37、94和150 mmHg)、pO₂及其交互作用对细胞生长及蛋白质量的影响，在新型的分离控制策略中pH采用HCL和NaOH进行调节，pCO₂进行离线调控。在对蛋白N端糖基化分析后发现半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖化(G1、S1、aF1)均在一定范围内变化，G1 25%-30%，S1 0.5%-1.5%和aF1 4%-8%。

如图1所示，半乳糖化、唾液酸化和岩藻糖化随培养参数的改变而变化，且当pH为7.2时，S1和aF1水平最高，且S1与Man8具有相关性(图1C)；而G1随pH和pCO₂的变化较为复杂，当pH为7.2且pCO₂为150 mmHg时，G1水平最低为21%，而当pH为6.8且pCO₂为150 mmHg时，G1水平最高为31%，pH为7.0且pCO₂为94 mmHg时，G1水平为30%；由此可推断出，当pH和pCO₂共同作用于细胞时，pH为主导作用，且当pCO₂达到150 mmHg的高水平时，不利于蛋白半乳糖化。由图1 D可知，高甘露糖糖型(M6和M8)与pH和pCO₂基本处于正相关的趋势，当pH分别为6.8和7.2时M6和M8分别最高。

图1 pH、pCO2、pO2及其交互作用对蛋白糖基化的影响

(图表来源于参考文献1)

Matthias的团队研究得出，提高pH可以促进唾液酸化水平，但有学者的结论恰恰相反。Ivarsson等在杂交瘤细胞HFN 7.1生产IgG1体系中发现当pH增加时，半乳糖化(G1)和唾液酸化(S1)会有所降低，而G0F的水平会增加，如图2所示。且当体系pH从6.8升高到8.0时，G1水平从0.43降低到0.24，S1水平从0.15降低到0.08，接近50%的降低比例，而岩藻糖化(F1)水平基本不变(0.99→0.94)(文中数据未体现)。关于pH变化对糖基化影响的机理，Ivarsson结出的解释是pH影响了体系中铵离子水平，进而影响到高尔基体内的糖基转移酶，因此影响到糖基化水平。

图2 不同的pH对IgG1糖基化的影响

(图表来源于参考文献2)

不同学者认为，pH对蛋白糖基化的影响是不一样的，可以说是case-by-case的情况。Trummer等的实验结果认为当pH在6.8和7.3之间变化时，对EPO-FC唾液酸化几乎无影响。Muthing等发现，培养体系的pH增加会提高IgG3的G2F水平及岩藻糖化。Yoon等研究结果表明，提高体系的pH可以降低Epo的唾液酸化水平。

Borys等在CHO体系中研究了pCO₂及用于调节pH的碱对蛋白唾液酸化的影响，实验过程中采用的pCO₂范围有20-40 mmHg、40-80 mmHg及140 mmHg，碱有两种：碳酸钠和氢氧化钠，并且Borys将唾液酸分成Neu5Ac和Neu5Gc(非人类表达，但其免疫原性还不明确)两种进行研究。

在研究pCO₂的影响时，保持体系中的pH在6.85-6.95，且是在D3天或D6天开启pCO₂控制，使其保持在低(20-40 mmHg)、中(40-80 mmHg)和高(140 mmHg)三个水平，其对细胞表现及蛋白唾液酸化的影响如图3所示。收获时，当pCO₂控制在20-80 mmHg水平时Neu5Gc含量为0.13，而当在D3天或D6天将pCO₂控制在140 mmHg时Neu5Gc含量为0.07。而Neu5Ac水平随pCO2的变化并不明显，低水平pCO₂时为0.78，高水平pCO₂时为0.75。就总唾液酸水平讲，高pCO2时为0.82，低pCO₂时为0.91，即维持一定的pH并提高pCO₂水平时可以降低蛋白的唾液酸化。Zanghi等学者的研究也表明提高pCO₂水平会降低蛋白的唾液酸化，pCO₂对唾液化表现不同的影响因素较为复杂，有研究称当pCO₂水平高过110 mmHg时对细胞具有毒性，高水平的pCO₂可能会影响细胞内的CMAH或NADH水平。

图3 控制不同的pCO2水平对细胞表现及蛋白唾液酸化的影响

(图表来源于参考文献3)

在对采用不同碱调控pH对蛋白唾液酸化的影响中，碳酸钠(Sodium Carbonate)较氢氧化钠(Sodium Hydroxide)对体系渗透压的影响均低于6%，且pCO₂基本均维持在60 mmHg。Borys等发现使用碳酸钠时较氢氧化钠的唾液酸化水平高，如图4所示，不论是Neu5Ac和Neu5Gc水平，当使用碳酸钠作为碱液时均较氢氧化钠为碱液时水平高(0.90→0.80、0.15→0.10)，同时当碳酸钠作为碱液时非唾液酸化水平也有所降低。两种类似的体系中造成唾液酸含量不同的原因，Borys认为采用碳酸钠作为碱液时引起唾液酸转移酶活性的升高，进而促使Neu5Ac和Neu5Gc水平提高，但要具体确定其机制还需更多的实验研究。

图4 碳酸钠和氢氧化钠调控pH对细胞表现及蛋白唾液酸化的影响

(图表来源于参考文献3)

参考来源：

1.    Investigationof the interactions of critical scale-up parameters (pH, pO2 and pCO2) on CHObatch performance and critical quality attributes；

2.    Evaluatingthe impact of cell culture process parameterson monoclonal antibodyN-glycosylation；

3.    Effectsof Culture Conditions on N-Glycolylneuraminic Acid (Neu5Gc) Content of a RecombinantFusion Protein Produced in CHO Cells。