第一个PD-1抗体：Opdivo的开发故事
▍来源：美中药源
随着PD-1抗体药物欧狄沃(英文商品名: Opdivo, 英文通用名:Nivolumab)已于8月28号在中国进入铺货销售阶段，国内肺癌患者终于可以使用到这一革命性的抗癌药物。作者由于工作原因，过去一年多里阅读了一些这个药物的开发历程的文献。发现之前中文报道中，多少有些和作者了解到的事实有所出入，特撰此文，供大家讨论。
第一部分：PD-1的发现和功能鉴定
1992年，日本科学家TasukuHonjo (本庶佑) 从小鼠上分离、鉴定了PD-1基因，得到了小鼠PD-1蛋白，这一成果发表在1992年的EMBO杂志上(1)。在这篇文章中，本庶佑认为属于免疫球蛋白超家族的PD-1的活化会导致T细胞的凋亡，这也是PD-1蛋白的命名由来（Programmed Death-1）。本庶佑在这篇文章中公布了PD-1蛋白的序列，随后几年接连发表了一系列研究PD-1的成果，如1994年他找到了人类PD-1基因和蛋白（2），并在1999年首先提出PD-1是一个免疫系统的负调控因子（3）。这一成果在当时并未引起学界太多重视，就连本庶佑本人也是以B细胞的发育和功能作为自己的主要研究方向。
2000年，在丹娜法伯癌症研究院（Dana-Farber Cancer Institute, DFCI，隶属于哈佛大学医学院）工作的Gordon Freeman和本庶佑作为第一作者和通讯作者，共同阐述了PD-1/PD-L1对人体T细胞的调控作用，这一领域才逐渐引起重视（4）。在这篇文章中，Freeman等人不仅发现了属于B7蛋白家族的PD-L1蛋白是PD-1的配体，还首先证明了 PD-L1通过结合PD-1，抑制了T细胞的增殖和分泌细胞因子功能。Freeman关注到PD-1并非偶然，他和妻子Arlene Sharpe一直从事B7蛋白家族的研究。他们先前就通过生物信息学的办法找到了很多和B7蛋白基因相似的B7蛋白家族成员。根据CTLA-4蛋白会和B7家族的B7-1、B7-2蛋白结合, PD-1蛋白又和CTLA-4结构有类似片段，同属一个蛋白家族等已知信息，Freeman推测自己发现的B7蛋白家族中，可能有PD-1的配体。当时PD-1尚未成为热门研究领域，没有商业化的PD-1蛋白供实验用，Freeman于是和本庶佑合作，就此发现了PD-L1和PD-1在免疫系统里的负调控功能。Gordon Freeman 79年哈佛博士毕业后就加入了DFCI，从博士后做起。本庶佑1984年开始就在东京大学任职，先前中文报道里有不少说Gordon Freeman是本庶佑的博士后，这个说法应不是事实。
华裔学者陈列平教授当时也从事B7家族蛋白的研究，通过和Freeman类似的生物信息学方法，他于1999年12月首先发表了PD-L1的基因及蛋白序列(5)，在这篇文章中，陈列平以B7H1称呼PD-L1蛋白。遗憾的是陈列平没有找到B7H1的配体，而且标题中认为B7H1是共刺激T细胞的增殖，这和后来多数人的认知略有不同。陈列平的文章比Freeman早10个月公布。Freeman的相关专利于1999年8月提交，比陈列平早3个月，在这个专利中Freeman也公布了PD-L1的序列，可以认为陈列平和Freeman几乎同时发现了PD-L1蛋白。后来陈列平于2002年发表文章，指出大多数肿瘤细胞通过表达PD-L1实现免疫逃逸（6），这为开发PD-1/PD-L1药物用于癌症治疗提供了重要理论依据。
在发现PD-1/PD-L1通路对T细胞有负调控作用后，当时科学家们普遍认为这条通路可能用于自身免疫疾病药物的开发，2001年6月左右，本庶佑与小野制药(ono pharmaceutical)一起提交了一项国际专利：substance specific to human PD-1(7)。在这个专利保护下，任何物质，只要特异性与人PD-1蛋白结合，就侵犯了本庶佑和小野制药的专利。这个专利在今天可能不会被批准：专利的内容主要是PD-1的基因和蛋白序列，没有列出证据证明阻断PD-1可以用作免疫疗法。这个专利的影响，随后还会提到。
第二部分：Medarex的研发过程
2001年初，王常玉从Chiron公司作为研发科学家加入Medarex公司，在Chiron期间，王常玉研发了CD-40抗体，这个产品今天还在诺华公司的开发管线里。此时Medarex的CTLA-4抗体开发已进入后期，公司开始考虑后续项目。基于下述几点原因，Medarex的开发团队选中了PD-1/PD-L1作为新靶点开发肿瘤免疫药物：
PD-1和CTLA-4同属一个蛋白家族，开发同类产品对Medarex这样的小型公司来说或许能降低系统性风险。
本庶佑于1999年的文章（3）指出PD-1 敲除后的小鼠会出现一些自身免疫性疾病症状，在有些鼠系里表现为红斑狼疮，有些则表现为心肌炎（心肌炎这一副作用日后在接受PD-1抗体治疗的病人身上也出现过）。但发病较晚，没有像CTLA-4敲除小鼠出生后一月内很快死亡。证明PD-1/PD-L1通路与体内免疫调节有关系，但副作用可能较低。
PD-1/PD-L1通路是一个负调控因子，当时多数的免疫疗法类新药项目是激活免疫细胞上的靶点蛋白为目的，比如IL-2、CD40抗体、4-1BB抗体等。Medarex的研发团队认为，刺激免疫细胞的药物就像轰油门，临床开发的风险很高：难以控制毒性。而负调控因子就像踩刹车，这类因子往往只存在于已激活的T细胞里，比如正常的T细胞不表达PD-1，毒性相对较小。这一观点在后续的临床上也得到了验证：4-1BB抗体和CD40抗体的毒性都太强，很难控制。
十多年后回过头看，当时Medarex在这个项目上承担了巨大的风险：PD-1不是研究的热点，除了本庶佑团队的成果外没有什么文献和数据提供理论支持。Medarex在立项和开发时也没有得到任何外部人员的协助和指导，他们立项时甚至不知道本庶佑已经申请了关于PD-1的专利。Medarex对PD-1的认识也有一定局限性，并没有预测到PD-1抗体会成为新一代广谱性、革命性的抗癌药物。这也埋下了日后出售自己的种子。
除此以外，当时该项目的研究条件不充分，所有的实验材料都要靠Medarex团队自己解决。王常玉带领的团队启动这个项目时，PD-1，PD-L1, PD-L2这三个靶点蛋白都要自己动手PCR克隆基因并表达蛋白，而无法外购。当时很多实验条件也不成熟，需要在实践中摸索，最先攻克的是PD-L1的基因克隆和蛋白表达，所以在Medarex的内部代号里，PD-L1项目的代号是MDX-1105，反而排在PD-1项目MDX-1106前面，MDX-1107则是PD-L2项目的代号。
借助Medarex当时已有的人源化小鼠抗体平台，Medarex的研究人员用PD-1、PD-L1和PD-L2蛋白注射小鼠，并从小鼠脾脏里分离到了能生产上述抗体的B细胞，再通过融合B细胞和骨髓瘤细胞，就得到了能长期稳定产生上述抗体的杂交瘤细胞株。这项工作由是杂交瘤组的吴仪和黄海春协助完成。
通过测序知道筛选到的PD-1抗体的可变区后，Medarex团队设计了新的序列，将PD-1抗体的可变区与IgG4恒定区结合，同时将IgG4恒定区的228位点丝氨酸替换成脯氨酸，解决了天然IgG4抗体在体内的不稳定性问题。这样就得到了Nivolumab。
MDX-1106在抗体筛选阶段是比较顺利的，2001年初立项，同年底就拿到了先导抗体。随后的临床前开发工作花费了大量的时间，比如建立体外活性检测方法、小鼠动物模型及食蟹猴毒理实验方法等等。PD-1在当时仍属全新领域，基础科研缺乏积累，团队必须在一片空白中进行开拓性的研究，在实践中探索全新的实验方法。其中主要难点在于找到一个可靠的鲁棒性体外实验方法以评估抗体的功能和活性，经过一年多的努力，终于完成了方法的建立。随后的动物模型实验也多有波折，当时主流的小鼠肿瘤模型对PD-1抗体基本没有应答，直到2004年底才在MC38肿瘤模型上观察到了一定疗效。如今全球各地的PD-1/PD-L1抗体开发项目多会使用MC38肿瘤模型。
出于公司知识产权等方面的考虑，Medarex在完成Nivolumab的研发后，只通过专利的形式对Nivolumab进行了保护，未立刻发表文章。直到2014年Nivolumab上市前夕才发表文章，详细介绍了Nivolumab的筛选和鉴定过程及食蟹猴毒理实验数据（8），此文第一作者是王常玉。按照文中提及的团队分工，王常玉负责这个项目的概念设计、试验方法的开发等等工作以及项目的监督，是Nivolumab毫无争议的第一发明人。
2003年1月，本庶佑和小野制药的专利（7）公布了，Medarex意识到自己的PD-1抗体可能绕不开这个专利，作为早期研发型公司也需要合作伙伴分摊高昂的临床开发费用，双方于2005年5月13日宣布达成合作协议（9），新闻稿中明确提到使用小野制药的PD-1专利和Medarex的抗体开发平台以共同开发PD-1抗体。根据双方的协议，小野制药获得了PD-1抗体除北美以外的全球权益，而Medarex保留了PD-1抗体在北美的商业权益。有理由相信，本庶佑和小野制药并未重视PD-1单抗的临床价值。2011年，收购了Medarex的百时美施贵宝公司（BMS），没花什么代价就从小野制药换回了PD-1抗体在欧洲和中国的商业权益(10)。Nivolumab在中国开始销售的头两天的销售额金额已超过1.5亿元人民币，这恐怕远出乎签署协议双方的意料。
2004年前后，Medarex一方面和小野制药展开谈判，一方面也在构建自己的专利保护壁垒，赶在双方达成协议前的2005年5月9日，提交了多份和PD-1相关的专利：Methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies（11）、Human Monoclonal Antibodies To Programmed Death 1(PD-1) And Methods For Treating Cancer Using Anti-PD-1 Antibodies Alone or in Combination with Other Immunotherapeutics（12）、Methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies in combination with anti-CTLA-4 antibodies（13）等等。先前有不少中文报道中认为小野制药参与了PD-1抗体的开发，一个理由就是上述专利中有小野制药的名字。事实上，上述几份专利的申请机构和发明人均来自Medarex，与小野制药完全无关。权利人中包含小野制药的原因是2014年6月，BMS和小野制药为了准备起诉默沙东，双方交叉持有相互授权对方一系列专利，从而在这些专利上添加了小野制药。如果这些中文报道能看看专利的变迁过程，可能会有不同的结论。
2014年9月4日，在默沙东公司的PD-1单抗Keytruda获得美国FDA批准的当夜，BMS向默沙东公司提起了诉讼,称默沙东的Keytruda侵犯了BMS/小野制药关于PD-1抗体用于治疗癌症的系列专利。
2017年1月20日，BMS/小野制药公司宣布和默沙东就PD-1单抗的专利诉讼签署了一项和解及全球专利许可协议（14）：默沙东要向BMS/小野制药支付6.25亿美元的首付款，以及在2017～2023年间Keytruda销售额的6.5%，2024～2026年间Keytruda销售额的2.4%，BMS和小野将按75/25的比例分成。粗略估算默沙东总共将支付超过60亿美元。
第三部分：进入临床
2006年8月，Medarex的PD-1抗体MDX1106获得美国FDA批准进入临床I期试验，首批计划入组39名癌症复发的病人(15)。需要指出的是，Medarex的PD-L1抗体MDX1105也是全球首个进入临床阶段的PD-L1抗体，于2008年8月获得美国FDA批准进入临床I期，首批计划入组286名癌症复发的病人（16）。MDX1105的临床试验结果后来发表在新英格兰杂志上（23），遗憾的是BMS主动放弃了MDX1105的后续开发。
作为一个全新的肿瘤免疫药物，MDX1106早期的临床试验几经周折，由于对肿瘤免疫药物的不了解，最初的临床试验终点选择了传统靶向药物的临床试验终点：无进展生存期（PFS）和客观应答率（ORR）。肿瘤免疫药物在这两点上并不比传统靶向药物具有太多的优势。免疫药物的真正优势：药效持续时间长，应答的癌症病人存活期长，且有很大几率实现临床治愈等优势，要到临床试验进行好几年以后才能被观察到。Medarex管理层也对公司的未来有了疑虑，2009年，BMS以28亿美元收购了Medarex，Medarex最终没能独立运营到PD-1药物大放光彩，成为新一代广谱性革命性抗癌药物的那一天，这是让人扼腕叹息的。
上述临床试验的结果于2010年第一次公布（17），参与临床试验的病人中，一位结直肠癌患者实现了完全缓解，一位黑色素瘤患者和一位肾癌患者实现了部分缓解。另有两位黑色素瘤患者的肿瘤也得到了显著缩小。随后2012年在新英格兰杂志上的后续结果更是惊艳：18%的非小细胞肺癌患者、28%的黑色素瘤患者和27%的肾癌患者得到了缓解，起效的病人中有66%的疗效持续超过一年（18）。结合之后Medarex在各种医学年会的报告，这一临床结果引起了行业的重视，引来了同业的觊觎。
默沙东公司翻箱倒柜发现自己也有一个扔在后院垃圾堆里的PD-1抗体，来自于2009年5月并入默沙东的先灵葆雅公司。而先灵葆雅则从2007年收购荷兰 Organon时获得（19）。据福布斯日后的采访，Organon的PD-1抗体在2003年才开始构思，远落后于Medarex的MDX1106, 一开始的定位也是自身免疫性疾病（如类风湿关节炎）的辅助用药，而非癌症用药。随着两次收购带来的组织结构重组和研发重心变迁、癌症免疫药物的进展挫折不断，Organon的团队已被告知PD-1抗体的研发工作应予终止。但是2010年的BMS临床试验改变了一切，默沙东公司在意识到PD-1抗体在癌症治疗上的巨大空间后重启了自己的PD-1抗体项目（代号MK-3475)，并于2010年12月获得批准进入临床试验。
BMS后来宣称：为了追赶进度，默沙东不惜从BMS的前雇员Stephanie Schulman那里获得机密信息（20），BMS为此对上述双方都提起诉讼。在得知BMS不会在黑色素瘤适应症上快速推进PD-1抗体，以避免和自家已有的CTLA-4抗体Yervoy在黑色素瘤适应症上的竞争后。默沙东公司采用了一个激进的临床方案设计：代号Keynote001的临床I期试验不断扩大入组人数，从最初不到10人变成1260人。并用临床I期试验的结果在美国申请了上市批准，MK-3475于2014年9月4日获得批准，反而在黑色素瘤适应症上进度上超过了BMS，以Keytruda为商品名成为第一个在美国上市销售的PD-1抗体。
而BMS的PD-1抗体Nivolumab，以商品名Opdivo的名字于2014年6月在日本获得批准用于治疗黑色素瘤，成为全球第一个被批准的PD-1药物，随后于2014年12月在美国获得批准，2015年3月以创纪录的速度在申报后四天内得到美国FDA批准，用于治疗铂化疗后依然进展的转移性鳞状非小细胞肺癌。
后记
从本庶佑1992年发现PD-1蛋白，到2014年Nivolumab上市，中间经历了22年，即使从2000年明确PD-1/PD-L1的功能算起也经历了14年，药物研发的艰巨，可见一斑。毫无疑问，PD-1/PD-L1的发现要归功用于本庶佑等人，本庶佑很可能会因此获得诺贝尔奖，但从Nivolumab的发现过程也可看出，作为基础科学家，他们对这个药物的开发并无太多贡献。本庶佑和Freeman等人可能在之后的很多年都一直没意识到PD-1/PD-L1对癌症治疗的作用。
另一个例子是CTLA-4蛋白，之前一直认为，活化后的T细胞表面高表达CTLA-4蛋白，当抗原递呈细胞表面的B7家族蛋白（B7-1，B7-2）结合CTLA-4后，就起到抑制T细胞活化的作用。于是人们推测，CTLA-4单抗通过阻断CTLA-4与B7家族蛋白结合而负调控对T细胞的抑制。从而发挥抗肿瘤作用。2018年5月马里兰大学的刘阳和郑盼指出，这个假说可能是错的（21、22）。在这两篇文章中，他们指出，CTLA-4抗体是通过清除肿瘤局部的调节性T细胞，而不是阻断CTLA-4/B7信号通路来实现治疗癌症的疗效。这并不影响CTLA-4单抗成为一个年销售过10亿美元的重磅炸弹药物。有理由揣测，不远的将来可能会有人发现，PD-1抗体的抗癌疗效并不完全是因为阻断PD-1/PD-L1通路，而是另有门径。
中国的制药行业正在试图转型进军创新药开发，在为陈列平、王常玉等华人在肿瘤免疫领域做出的成功自豪的同时，这一领域曲折的几十年里可能也有一些经验和教训对中国的创新药行业有用。创新药离不开基础科研的积累，创新药的开发过程和基础科研的关系更像是果树与土地的关系。没有深厚的基础科研的积累，很难产生创新药。美国至今仍是基础科研实力最雄厚的国家，绝大多数的创新药也诞生在美国，这就好像贫瘠土地上的果树，难以长出丰硕的果实。但是没有果树的土地里也没法凭空长出水果来，最多长几颗山药蛋。没有本庶佑等人发现PD-1的功能，Opdivo的诞生无从谈起。没有Medarex团队独具慧眼研发PD-1抗体用于癌症治疗，本庶佑这一成果是否会淹没在故纸堆里我们今天已不得而知，从Organon自己的PD-1抗体项目来看，恐怕是凶多吉少。基础科学家和新药开发公司的定位不同，评估新药的临床意义和商业意义，不是基础科学家的职责，也不应该去期待基础科学家能完成创新药的研制和开发。Medarex团队筛选到抗体仅仅用了1年多，但是建立评价抗体功能的方法体系又花了2年，临床试验更是花了8年。默沙东公司在临床试验上的大胆设计，让原本进度落后4年的项目能和BMS最后同时冲线。一个药物从实验室走向市场，后续开发的重要性不比前期筛选低。从Medarex和小野制药的谈判结果不难看出，Medarex一开始就意识到PD-1抗体的重要性，和小野制药的合作手法多少有点合纵连横的味道，而小野制药则多少有点被蒙在鼓里。随着国内创新药的发展，创新药公司必然会开展一系列的外部合作，如何开展商务拓展，相信对国内大多数创新药公司都是一个挑战。
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