【药渡说】HCV药物研发进展综述（二）：NS3/4A蛋白酶抑制剂竞品分析

内容概要

NS3/4A蛋白的结构与功能

NS3/4A抑制策略与抑制剂的开发

NS3/4A抑制策略

第一代NS3/4A抑制剂的开发

第二代NS3/4A抑制剂的开发

NS3/4A抑制剂开发现状与分析

国际在研NS3/4A抑制剂

国内在研NS3/4A抑制剂

NS3/4A在HCV治疗中的地位与未来研发和市场预期

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导读：

1. 上期我们简单介绍了丙肝、丙肝病毒与抗丙肝治疗和药物。我们知道在过去丙肝的治疗一直是以广谱抗病毒药物利巴韦林与干扰素联用为主，早期市场上并无丙肝特异靶点的直接抗病毒（DAAs）药物。

2. NS3/4A蛋白酶抑制剂是最早上市的丙肝特异的直接抗病毒药物，自2011年FDA批准第一个NS3/4A蛋白酶抑制剂之后，蛋白酶抑制剂与干扰素/利巴韦林三联疗法被广泛应用。

3. 在2014年欧洲肝脏研究协会（EASL）推出的HCV临床实践指南中，该三联疗法被建议成为HCV基因型1型患者干扰素/利巴韦林治疗未完全根除后的推荐疗法。

4. 本期我们详细的了解NS3/4A蛋白酶与NS3/4A抑制剂的研发与现状。

1. NS3/4A蛋白酶结构与功能

丙肝病毒基因组含10个基因，编码膜蛋白E1与E2，核心蛋白、p7与非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B（图1）。丙肝病毒基因组翻译成一个多聚蛋白前体，需要蛋白酶水解成熟成为单体蛋白。

图1 丙肝病毒基因组基因构成

NS3/4A复合物具有丝氨酸蛋白酶活性的HCV非结构蛋白，催化丙肝病毒非结构蛋白水解成熟，是丙肝病毒生活周期所必须的。

NS3是HCV非结构蛋白，含631氨基酸残基，具有蛋白酶和RNA解旋酶双重活性。X晶体衍射发现呈胰蛋白酶样折叠，形成两个β片层和催化三联体含酶底物特异结合的位点，相比于其他丝氨酸蛋白酶，沟槽较浅。C端是一个Zn2+结合区，Zn2+离子的结合起到了稳定NS3/4A蛋白酶空间结构和正确折叠。N端约28-30个氨基酸残基与NS4A中段约12个疏水氨基酸残基的相互作用（图 2）。

图 2 NS3蛋白

A：NS3全长，其中虚线框内是NS3蛋白酶结构域；B是无NS4A情况下的NS3蛋白酶结构域，深色棍棒是催化位点的氨基酸残基；C：有NS4A类似肽情况下的NS3蛋白酶结构域，深色棍棒是NS4A模拟肽；

NS4A作为辅助因子，其N端20个疏水氨基酸残基与NS3丝氨酸蛋白酶N端结合形成非共价二聚体，共同执行丙肝病毒非结构蛋白水解和成熟。NS4A小分子蛋白，54个氨基酸残基，中间氨基酸残基亲水参与NS3/4A蛋白酶活性中心形成；C端20个氨基酸功能尚不明确（图 3）。NS4A活化NS3蛋白酶活性。NS4A的辅助作用相当保守，为药物设计提供可能。

图 3 HCV NS4A

NS3/4A蛋白酶水解HCV多聚蛋白前体中非结构蛋白，抑制其蛋白酶活性可以阻断HCV复制、翻译和翻译后多聚蛋白的加工成熟（图 4）。NS3/4A蛋白酶抑制剂是第一个成功上市的抗HCV直接抗病毒药物（DAAs）。

图 4 HCV蛋白酶及辅助因子NS3/4A（form medlive.cn）

NS3/4A蛋白酶抑制策略与抑制剂开发----抑制策略

根据NS3/4A蛋白酶结构与功能分析，开发NS3/4A蛋白酶抑制有以下三条策略：

1. 结合抑制NS3/4A蛋白酶活性位点（图 5）；

2. 阻断NS3蛋白酶与NS4A结合；

3. 干扰Zn2+结构域的形成；

图 5 NS3/4A蛋白酶结构示意图

以上三条策略的NS3/4A蛋白酶抑制剂均有开发并曾进入临床，但是至今为止已上市的NS3/4A蛋白酶抑制剂均基于结合并抑制NS3/4A蛋白酶活性位点，是不被分解的底物类似物（拟肽类物质）。根据其结合丝氨酸蛋白酶活性位点的方式大致可以分为两类。

1. 一类是可逆的共价结合抑制剂，包括2011年最早上市的Boceprevir与Telaprevir。
   

2. 另一类是非共价结合抑制剂，包括2013年以及之后上市的Simeprevir、Asunaprevir、Vaniprevir和Grazoprevir。

可逆共价结合NS3/4A抑制剂

现在开发的可逆共价结合NS3/4A抑制剂都是线性α酮酰胺类衍生物，与丙肝NS3/4A蛋白酶催化三联体中活性位点的丝氨酸共价结合，可逆的抑制NS3/4A蛋白酶。可逆共价结合NS3/4A抑制剂对NS3/4A的抑制HCV基因型1型选择性的，对其他基因型HCV作用不明显。

该类药物有telaprevir与boceprevir已上市（表2），结构与相关的特征见表1。

NS3/4A蛋白酶抑制剂与干扰素/利巴韦林的三联疗法联用，总体治疗周期是28~52周与24~48周。线性α酮酰胺类NS3/4A抑制剂极大的提高了持续病毒响应时间（SVR），约25~64%（原单纯干扰素/利巴韦林治疗方案SVR小于40%）。

线性α酮酰胺类NS3/4A抑制剂口服生物利用度差，毒性大；但是其最大的问题却是低耐药屏障（对耐药性产生的抵抗）与高交叉耐药性的问题。单药应用2周以上，患者快速出现耐药突变，并对耐药突变敏感性下降明显。最常见的耐药突变是R155和A156。

低耐药性屏障严重限制了可逆共价结合NS3/4A抑制剂的使用，随着2013年新一代NS3/4A抑制剂simeprevir与“史诗级”新药NS5B抑制剂索非布韦（Sofosbuvir）的上市，telaprevir与boceprevir逐渐淡出市场。

非共价结合NS3/4A抑制剂

非共价结合NS3/4A抑制剂，是线性或大环类羧肽类化合物，与HCV NS3/4A蛋白酶催化位点氨基酸残基产生静电相互作用结合，即非共价结合（图 6）。

非共价结合NS3/4A抑制剂虽然作为第一个进入临床的NS3/4A抑制剂，勃林格殷格翰开发BILN2061因为在动物体内提现心脏毒性而中止开发。但之后开发的非共价结合NS3/4A抑制剂，在可逆共价NS3/4A抑制剂的基础上，改善了药代动力学特性（提高口服生物利用度），通过使化合物与活性位点更紧密的结合，提高药物的活性。新开发的非共价结合NS3/4A抑制剂对基因型1型以外的HCV有明显的抑制。

新开发的非共价结合NS3/4A抑制剂虽然能够抑制可逆共价结合NS3/4A抑制剂产生耐药突变的HCV，但是耐药屏障效果能然很低，并且与可逆共价结合NS3/4A抑制剂一样存在交叉耐药。

图 6 非共价结合NS3/4A抑制剂作用示意图

（例：semprevir）

杨森公司（强生子公司）开发的Simeprevir是第一个上市的非共价结合NS3/4A抑制剂，于2013年被FDA批准上市。Simeprevir出现可以说对NS3/4A抑制剂的开发是革命性的。其不仅表现了对NS3/4蛋白酶极高的抑制活性，而且临床上与干扰素/利巴韦林合用的三联疗法表现了极高的治愈率，12周持续病毒响应时间（SVR12）高达88.6% ，相对之前的疗法有了极大的提高，同时治疗周期也缩短到12周（不足原来的1/4-1/2）。Simeprevir不但对可逆共价结合NS3/4A抑制剂产生的耐药突变R155/A156 HCV同样有着抑制效果，而且对其他基因型HCV同样有抑制效果（虽然FDA批准的治疗范围目前仅有基因型1型HCV）。

Simeprevir以其良好的治疗效果，于上市第二年（2014年）创下了年销售额23亿美元的佳绩。然而既生瑜何生亮，同年上市的吉利德“史诗级”新药NS5B抑制剂索非布韦（Sofosbuvir），以更好的治疗效果（SVR12），更广谱的抗病毒活性（FDA批准治疗基因型1-4型HCV感染），更好的耐药屏障作用，极低的交叉耐药可能性（NS3/4A抑制剂均有交叉耐药的风险）迅速占领市场，创造了销售奇迹。在索非布韦的阴影之下，强生公司推出了simeprevir与索非布韦联用的治疗组合，以期在Sofosbuvir及其复方药物统治的抗丙肝市场上分一杯羹。

2014年后百时美施贵宝和默沙东相续推出了自己的新一代NS3/4A蛋白酶抑制剂及其治疗组合，表现了极佳的治疗效果。关于各大巨头推出的治疗组合的对比与分析，咱们将在本HCV药物研发进展与分析的第五期中详细介绍。

图 7 四种非共价结合NS3/4A抑制剂结构式

其他NS3/4A抑制剂

基于另两条抑制策略的NS3/4A抑制剂也有研究，并有多个药物曾经进入临床，但因为毒性的各方面原因未能推向市场。鉴于近年来大量疗效惊人的抗HCV药物与治疗组合的问世，未知方式的抗HCV药物研究就目前来看从风险与收益的角度没有太多的研究价值。

3. NS3/4A抑制剂研究现状与分析

国际上对于NS3/4抑制剂的研究如火如荼，目前已经有6个药物或单药或以复方组分的方式先后推向市场。目前国际上还在进行临床的NS3/4A抑制剂有如下：

图 8 国际临床在研NS3/4A抑制剂结构式

国内NS3/4A蛋白酶抑制剂研究进展

苏州银杏树药业开发的1.1类新药抗HCV NS3/4A抑制剂赛拉瑞韦国内正大天晴2013年以3000万美元购买了BioLineRx公司的HCV NS3/4A抑制剂BL-8030在中国大陆和香港的开发与市场权益。目前未见其申请临床。BL-8030在体外对基因型1a/1b/2a的HCV病毒有很强的抑制活性，同时对其他NS3/4A抑制剂耐药突变高度敏感。表现不错的体内PK效果，不错的口服生物利用度（100 mg达33.7%大大高于早期的可逆共价结合抑制剂），很长的药物肝脏滞留时间等。

4. 展望

对于未来的NS3/4A抑制剂开发，本人表示不太乐观，鉴于自2013年不断推出的抗HCV治疗组合均有着惊人的疗效，除非在这些产品未进入的市场（如中国等）能快速推出疗效相当的新药，否则难以在诸多强劲竞争对手的手下抢得市场。

从技术上来说，对于催化位点为作用位点的抑制剂开发，现在上市的药物已经表现足够好，但是因为作用位点的原因，耐药屏障与交叉耐药的问题仍然难已解决。如果不在这两方面解决问题，新NS3/4A抑制剂很难表现比现有药物更出色的效果。如果要想在治疗效果和耐药等方面有所突破，新的NS3/4A抑制剂必须的依赖新的作用机制，如阻断NS3与NS4A结合等。新作用方式药物的开发，风险未可知；而现行的治疗药物治疗效果极佳，所以新机制药物开发的风险收益比极低。

从市场与经济的角度来看，自2013年以后，吉利德、艾伯维、百时美施贵宝、杨森和默沙东都先后推出了自己的抗丙肝药物与组合而且疗效极佳（SVR12都达到90-100%）。鉴于这些药物与治疗组合已经逐渐统治市场，NS3/4A抑制剂的开发将受到严重阻碍。极低的风险收益比使得新的NS3/4A抑制剂研发难以受到资本的青睐。

注：文中阐述仅代表作者个人观点

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