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江南大学康振课题组:工程化大肠杆菌高效生产四氢嘧啶

GreenChE编辑部 绿色化学工程 2022-12-31



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研究背景


      四氢嘧啶(Ectoine)是一种环状天冬氨酸衍生物,可以减轻极端环境对蛋白质、核酸和细胞膜的有害影响以保护活细胞,广泛应用于酶工业、化妆品和生物医学等领域,然而居高不下的生产成本限制了其在消费市场上的推广。因此通过工程化菌株高效生产四氢嘧啶,大幅降低生产成本将是十分有价值的。


近日,江南大学康振教授课题组通过工程化大肠杆菌,优化补料分批发酵工艺实现了以葡萄糖作为唯一碳源高产四氢嘧啶,为其他天冬氨酸衍生物的微生物制造提供了重要思路。文章发表在Green Chemical Engineering (GreenChE),题为“Engineering Escherichia coli for high-yield production of ectoine”(DOI: 10.1016/j.gce.2021.09.002)。




02

研究亮点


• 通过核糖体结合序列优化策略微调ectA、ectB和ectC的表达

• 引入谷氨酸棒状杆菌来源的天冬氨酸激酶LysC和伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶Asd以增强四氢嘧啶前体的供应

• 工程菌株经补料分批发酵四氢嘧啶产量达60.7 g/L,葡萄糖转化率为0.25 g/g


03

内容概述


图1. 重组大肠杆菌合成四氢嘧啶的路线示意图

首先以高拷贝质粒pRSFDuet-1作为表达载体,将伸长盐单胞菌来源四氢嘧啶合成基因簇ectABC引入大肠杆菌BL21(DE3),实现四氢嘧啶的异源合成,产量达0.8 g/L (图2)。

图2.不同表达宿主(a)和表达载体(b)的选择


通过预测与设计不同强度的RBS序列来替换ectABC基因簇的天然RBS序列,实现了这三种酶的协调表达,发现上调ectA且下调ectC的表达最有利于四氢嘧啶合成,产量达1.6 g/L (图3)。图3. RBS优化组合策略,RBS强度高低由颜色深浅表示


为了避免反馈抑制并增强前体的供应,引入了谷氨酸棒杆菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶CgPpc和丙酮酸羧化酶CgPyc、铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸脱氢酶PaeAspDH、谷氨酸棒杆菌来源的具有G1A和C932T突变的天冬氨酸激酶CgLysC、伸长盐单胞菌来源的天冬氨酸半醛脱氢酶HeAsd和枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶BsRocG (图4a),发现CgLysC和HeAsd组合表达最有利于前体天冬氨酸半醛的积累 (图4c),四氢嘧啶产量提高至5.5 g/L。


图4. 前体天冬氨酸半醛合成的增强:(a)合成途径的优化;(b)单个外源基因的引入;(c)组合外源基因的引入


最终得到的重组工程菌株ECT VIII经分批补料发酵条件优化,在3-L发酵罐中培养56 h,四氢嘧啶产量达到 60.7 g/L (图5),产率为1.08 g/L/h,葡萄糖转化率为0.25 g/g,为理论转化率的40%。

图5. 重组菌株补料分批发酵生产四氢嘧啶


04

总结与展望


近年来,该课题组致力于利用代谢工程和合成生物学策略,构建绿色合成路线生产透明质酸、硫酸软骨素以及各类氨基酸衍生物等高价值产品,推进其实现产业化。


该工作通过选择表达宿主和载体、核糖体结合序列设计优化四氢嘧啶合成途径以及增强前体供应,以葡萄糖为唯一碳源进行补料分批发酵四氢嘧啶产量可达60.7 g/L。由于避免了基因敲除策略,构建的重组菌株比其他产生四氢嘧啶的菌株表现出更强的适应性、更强的生长能力以及更高的生产力。该工作为大肠杆菌合成其他天冬氨酸衍生物提供了思路。








Title: Engineering Escherichia coli for high-yield production of ectoine

Authors: Daoan Wang, Jiamin Chen, Yang Wang*, Guocheng Du, Zhen Kang*

DOI:10.1016/j.gce.2021.09.002

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 通讯作者简介

作者简介

康振 教授

康振,博士、教授、博士生导师。江苏省杰出青年基金获得者,入选江苏省“六大人才高峰”、济南市“泉城学者”等人才项目。从事微生物合成生物学与代谢工程研究,主持国家自然科学基金项目、国家重点研发计划课题、江苏省科技支撑项目、企业横向课题等20项,转让水蛭透明质酸水解酶、低分子量透明质酸、硫酸软骨素等6项技术并产业化。以第一完成人获中国轻工业联合会技术发明二等奖1项,获首届“张天民糖类药物”杰出青年奖。以第一作者或通讯作者在Nature Communications、ACS Catalysis、Green Chemistry、Metabolic Engineering、Carbohydrate Polymers、Biotechnology and Bioengineering等主流杂志发表高水平SCI研究论文70篇,参与出版英文专著2部,授权中国发明专利52件,美国发明专利4件;担任江苏省生物技术协会青年专家委员会副主任、BMC Biotechnology副编辑;Enzyme and Microbial Technology、Frontiers in Biotechnology and Bioengineering、Biotechnology Letters杂志编委。

王阳  副研究员

王阳,江南大学副研究员。主要从事糖多糖聚合物的微生物合成、膜蛋白质工程和合成生物学调控元件开发的研究工作。以第一作或共同第一者身份在Nature Communications、ACS Catalysis、ACS Synthetic Biology等期刊发表论文6篇,参与编写专著1章;申请/授权中国发明专利9件。主持包括国家自然科学基金、国家重点研发子课题与企业横向项目4项。



期刊简介

Green Chemical EngineeringGreenChE)于2019年入选“中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊”,2020年9月正式创刊。GreenChE以绿色化工为学科基础,聚焦"绿色",立足"工程" ,注重绿色化学、绿色化工及其交叉领域的前沿问题,紧紧围绕低碳化、清洁化和节能化的发展要求。目前是对读者和作者双向免费的开源期刊。


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