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元码基因田埂:完美的液体活检要符合“四定”标准

2016-11-10 田埂 贝壳社


文|田埂


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 以下录音(部分)

谢谢贝壳社的邀请,非常荣幸今天有这么样一个机会跟大家分享一些自己在液体活检领域里的研究和产业化的感受。


今天题目:“理想与现实”,目前的现实是:理想很丰满,现实也不那么骨感。但是我想从现实到理想的这个过程是需要创业者、从业者,从基础研究到技术准备,再到临床转化,直至最后的临床应用路径,各个方面的结合。其实,从现实走到未来的理想状态,需要我们每个人的努力,这也是我作为一个从业者的一些感受吧。


液体活检相比传统活检有优势,目前集中在肿瘤诊断领域


首先介绍一下液体活检。顾名思义,液体活检就是通过液体(主要是血液)检测的方式来进行肿瘤的检测。目前,这个概念基本上还集中在肿瘤诊断领域,但是我想未来呢,它应该可以扩展到很多其他疾病的检测领域里。这一张PPT用的图是一个美国的液体活检创业公司inivata制作的一张图,我觉得这张图非常得漂亮,它同时也能够代表液体活检的一些概念,所以把这个图给大家分享一下。




与标准或者传统的活检相比,液体活检有明显的优势。我们知道传统的活检就是通过穿刺针,医生用一个介导的方式:超声或者其他影像学的手段,找到病人肿瘤组织所在的位置,然后对它进行一个穿刺、取样,这个过程是比较费时费力的,并且至少在医院里是要预约的(时间是要预约的)。组织的定位也比较难,特别是像甲状腺结节这种埋得比较深的组织,其实取样还是很难的。而且如果肿瘤组织特别小的话,对取样大夫的要求也很高,它们不易获取。同时,对患者也会带来一定的痛苦和风险,比如感染的风险,比如有扩散的风险等等。而且它同时是一种有创的方式。而且肿瘤组织有异质性,活检取样不一定能代表肿瘤组织的全貌。




而液体活检呢,通过血液的检测方法,可以跟常规的检测一起,非常快速的进行样本采样。同时,相对组织活检,液体活检能解决肿瘤异质性的问题,这是由于液体活检从血液里面获得的是相对综合性的肿瘤信息。总而言之,液体活检不仅样本易于获取,也减少了病人的痛苦和风险,相当于是仅需非常小的创伤就能取得更“真实的”样本并达到检测的目的。所以从这些角度而言,液体活检有它先天的优势在这里,这也是为什么现在液体活检非常热的一个根本的原因。


什么是“完美的液体活检”?要符合“四定”标准


什么是“完美的液体活检”?这是一个我想所有的从业者都会思考的一个问题。那么在什么状况下我们能够得到一个理想的液体活检?我们希望液体活检能够给我们提供什么样的信息?“完整的、综合的、指导临床的”,我想这可能就是每一个人心目中,或者每一个从业者心目中的完美的液体活检。


我把“完美的液体活检”总结为这几个方面,就是这个液体活检技术它要能够实现这四个“定”。



首先是“定性”。它能不能找到肿瘤,这个可能是一个最基本的要求:能不能找到来源于肿瘤的这些细胞也罢,DNA也罢,其他的标志物也罢。找到的标志物是否能够代表肿瘤相关的特征?能否进行肿瘤的分子分型?如果能够实现这几点,我想“定性”这个基本的要求应该是能够实现的。


那么第二个要求就是“定量”的要求。我们能够找到多少来源于肿瘤的这种标志物?它又能够代表肿瘤的多少特征?能否代表肿瘤分期的情况?这些问题,实际上就是“定量”需要解答的。


第三个就是“定位”。能不能够对血液里面找到的这个肿瘤的突变也罢,其他的标志物也罢,定位到哪一个器官或者哪一个部位上去?因为对传统的活检来讲,你至少是先知道部位的,但是对液体活检来讲可能并不知道来源部位。比如说肿瘤可能有转移,转移到其他部位去了,是不是能够提前地预判。


第四个要求是“定序”,是跟“定位”相关联的。也就是说我们能不能够判断这个肿瘤是从哪里来,它未来有可能往哪里去?这些信息都是可以指导临床的信息。


在我看来,如果能够真正意义上做到这四点,那么这个液体活检就是真正意义上的,我们叫完美的液体活检。




我们知道肿瘤相关的标志物,特别是释放到血液里的这些标志物,它在肿瘤不同的阶段其实有不同的特征,这些特征其实就能代表肿瘤发展的状况。所以在肿瘤的不同阶段,液体活检会有不同的意义和它存在的价值。如果能够发挥出来它的意义和存在的价值的话,对整个肿瘤的治疗过程会有非常好的指导性的作用。


首先,我们看一下血液的组成。我们知道从身体里获取血液之后,可以进行一个分离。那么能够分离出来什么呢?这里我们关心的是肿瘤来源的细胞,肿瘤来源的DNA和肿瘤来源的其他的标志物。




这里,我们可以看到这里面的一些特征,这个PPT我觉得(做得)特别好,就是它既表现了血液里不同的成分,同时也对这些成分进行了一个定量的统计。这个统计结果只是血液里面不同的成分,至于能够准确检测它的含量,对技术的要求肯定是不一样的。特别是对这种ctDNA而言,我们知道它是非常非常少量的,所以对检测技术的要求就非常得高,而对肿瘤循环的细胞而言,它的含量也是极低的,那么对它富集技术的要求就会非常高。


液体活检三个发展方向各有特点,为何ctDNA独占鳌头?


我们现在谈到液体活检,大家基本上会有一个基本的概念,就是它包括三个主要的成员,当然后面我也会讲到还有别的成员的存在。那么目前谈到液体活检主要是指这三个——CTC、ctDNA和Exosome。这个顺序是根据发现的不同的顺序来展示的。




我们知道CTC就是肿瘤循环细胞,它是最早被发现的。CTC的发现历史可以追溯到1869年,是一位澳大利亚的医生,他最早提出了CTC这么一个概念。后来逐渐被证实,包括证实它跟化疗、跟治疗的关系。CTC检测也是最早一个被商业化的液体活检的技术。




ctDNA是第二个,1948年的时候,科技工作者就已经发现了癌症病人他的外周血中有ctDNA,也就是肿瘤循环DNA的存在。


外泌体是最后一个被发现的,是1987年被报道出来。最近两年在科学上的进展也非常地快,后面我会有一些简单的介绍。


肿瘤循环细胞是最早一个被发现的,顾名思义它就是从实体瘤脱落出来的进入到外周血的肿瘤细胞。那么CTC被循环系统也就是随着血液的循环带到身体的各处,在某些环境下聚集之后,它就可能形成新的肿瘤。CTC形成机制研究也有很多学说,不可否认的是CTC是肿瘤转移的最重要的机制。但是这里面也有一些争议。但是毫无疑问,因为它是发现得最早,也是相对最成熟的,第一个拿到FDA注册证的,就是美国强生公司的cell search系统。




CTC的检测方法也非常地多,最早的通过抗体富集的方法,包括阴性富集的方法,还有其他的方法,通过细胞大小、粒径以及表面抗体来进行分离,技术也非常多,发展也非常快。我们都知道现在也是非常热,国内也有很多机构在这一方面努力,包括前一阵拿到注册证的格诺生物的叶酸受体为指标的CTC的富集和检测技术以及慧骏生物的CTC挑取和分离技术,都是非常有特点的技术。这些技术让CTC的临床应用成为现实。我们知道最早就是强生公司的7.5ml血大于等于5个的细胞来进行预后的评估。但是非常遗憾,强生今年宣布停产,对整个行业都有不小的打击。那么未来会是什么样的走向,现在还不太清楚。但是它毕竟是一个以前的标杆性的技术,我们要对它的探索作用有非常正面的一个评价。


ctDNA就是由肿瘤细胞释放到血液循环系统里面的DNA,它主要是来源于细胞的分泌作用、吞噬作用、坏死以及外泌体破裂之后释放的这部分DNA。因为它直接就到分子层面了,像前面CTC原来是细胞层面的,它到分子层面了,所以它的检测也是能够直接地代表肿瘤的分子状况。所以现在的发展也比较快,那么后面会详细地介绍ctDNA,这里就不多说了。




外泌体是另外一个现在非常热的液体活检的领域。它是直接30—100个纳米级别的极小的包裹的结构,内部有核酸和蛋白等物质,因为存在这么多的物质,那么我们就可以通过检测它代表原发部位肿瘤的一些特征。最近这个领域发展也特别得快,特别是我记得今年发表过一篇胰腺癌的外泌体研究论文,这也是非常让人惊讶的一个进展。希望这个方面的进展越来越快,真正意义上为病人能够提供临床指导。




从这张PPT,我们可以看到,其实在这几个液体活检主要的发展方向上面,每一个方向都有自己的特征。




比如说,如果我们要进行基因测序的话,那么ctDNA和CTC就是很好的一个载体,他们能够从DNA水平上代表整个肿瘤基因组的特征,是一个综合性的特征。如果我们在意,比如细胞质量、免疫代谢的一些情况,那么外泌体可能就是一个更好的检测指标。如果是(在意)基因组、转录组和蛋白水平的(情况),CTC可能是一个更好的指标,所以说这几个技术本质上来讲,是各有所长的,每一个方向都是有自己的特点。这里是一个简单的总结,就是每一个方向它的特点是什么,这里我就不赘述了,大家可以简单看一下。


当然可能我们今天这个主题是“理想的方法到底是什么”,那么我们从这里面看,其实似乎从每一个维度上看每一个技术、每一个方向都有自己的特点。但是下面我会讲“为什么说我们现在液体活检在ctDNA检测这个方向上会更热一些”。其实就是因为这几年的技术上的发展,在ctDNA的检测技术上有了比较大的突破。




看这张PPT,左边这只流血的手上,我想可能大家对这个图都非常的熟悉,这就是2015年MIT评选的十大Breakthrough Technologies里面排第七位的液体活检,通过快速的DNA检测技术能够获得肿瘤样本里的肿瘤特征性信息。这个评选来源于2013年的这篇文章,是乳腺癌的ctDNA研究。右边这个医学杂志的文章,就是他们通过乳腺癌病人观测到这个PIK3CA相关的突变,那么对它的治疗效果进行了一个评估。


ctDNA为什么能在近期的进展里面,我们说是独占鳌头啊,就是发展非常快、很热。本质上来讲,它是得益于靶向药物指导基因检测逐渐地成熟,是ctDNA检测技术得以发展并超车的一个关键。高通量测序技术发展,是ctDNA检测技术得以最近热炒、发展很快的一个最重要的基础。因为有了这两点,ctDNA的检测技术才能在,我们叫“三足鼎立”之下独占鳌头,或者说能够获得很大的发展。因为它的检测直接就可以指导用药了,直接就会对治疗产生本质性的影响,跟这个CTC用来评估预后,用来评估肿瘤复发还不是一个层面上的事情,它是更直接的对临床的指导,所以才能成为最近发展的热点的方向或者说最热的发展方向。


游离DNA的生物学


下面介绍一些游离DNA的一些基本的特点,我想这个PPT,后面这几页PPT可能我之前也做过一些分享,如果大家不感兴趣的话可以再往后看。




我们知道肿瘤细胞,正常的细胞获得突变之后,它就会变成肿瘤前兆细胞或者肿瘤细胞,积累到一定阶段就会出现这种mutation。之后呢,这个细胞就会发生一个本质性的变化,变成一个肿瘤,失去细胞周期和原有的细胞周期调控机制。所以肿瘤相关突变的检测就变成肿瘤检测非常重要的一个方面。




ctDNA就是外周血游离的DNA,它是来源于很多个不同的组织,最多的肯定是来源于外周血的凋亡的细胞,白细胞凋亡的来源是最多,达到90%以上。那么游离DNA,我们知道刚刚拿到中国的“诺贝尔奖”的卢煜明教授,他就是这个方面研究的专家。最早是1997年,他报道了在母体的外周血里面找到胎儿的游离的DNA,就是女性怀了一个男胎,那么检测到母亲的外周血里的Y染色体证明了游离DNA的存在。是母亲的游离DNA能够代表胎儿的情况,这是最早的一个发现。




这篇文章也是今年发表的,今年好像是6月份还是7月份发表这篇文章。它说明了游离DNA的一些基本的特征。前面讲卢煜明,他是发现这个游离DNA集中在160—190bp这个范围之内,而后面这篇文章它说明了:肿瘤相关的突变可能发生的DNA片断化,就是游离DNA的片断更小一些。就是可能肿瘤来源的这个DNA的damage情况就是损伤的情况更剧烈,或者说它的这个核小体包裹的情况更加的不规律,它的规律跟正常的游离DNA不太一样。




我们知道JHU的Bert在游离DNA的研究领域属于一个领导地位,或者说处于一个领袖地位的这么一个科学家,他和他在JHU,The Johns Hopkins University以及在澳大利亚的合作伙伴,一起发表了很多游离DNA相关的的文章,这就是其中之一比较有影响力的一篇。就是讲,随着治疗的变化游离DNA的含量在不停地变化,就是如果说病人对治疗有response的话,他的游离DNA会有不同的特征,会随着治疗的增加然后逐渐地降低,会呈现一个相对应的曲线出来。




那么这个表也是他最早做的一个研究,就是游离DNA在术后很快,两个小时可能就会消失,同时他们在不同的肿瘤里面也观察到了不同的特征,并且把这个特征都已经申请了专利。右边这个小图,这三个连着的曲线其实就是我查的他们申请的专利的截图。通过这个来评估化疗或者治疗的效果,会成为未来游离DNA检测的一个重要的应用领域。




这个是Guradant health也就是目前全世界发表了最多液体活检数据的一个公司,他们发表了一篇文章,去年的一篇文章,我记得是5000多例的数据。他们主要的发现就是在游离DNA里面跟肿瘤相关的这种突变的frequency,也就是突变频率是非常低的,基本上在低于千分之四的这么样一个水平上,这就证明ctDNA大部分的突变都是低频率的。




这个左边是那篇经典的Science杂志上的一篇文章,它是来自于14种肿瘤的136例样本的数据,也可以证明在不同的癌种里面游离DNA的含量是不一样的。右边这个小图是Guradant health在今年的ASCO会议上它发表的一个数据,也是5000多例的数据,来自于15种不同的主要的肿瘤。平均的检出率超过了85%。我记得是黑素瘤和脑胶质瘤它的检出率比较低,其他的肿瘤检出率还挺高。




从点突变的角度比较,CTC和ctDNA的比较,我们可以明显地看到,ctDNA能检测出更多的突变,并且这些突变更明显。这个图也是Guradant health在ASCO会议上的一个图、一个数据。从这个数据里看,我们可以看到游离DNA的检测,从高通量测序进行游离DNA检测,它能够在很大程度上或者说是接近完美的一个程度上检测到原发的mutation,那么对继续的mutation的检测是相对比较差的,对扩增的检测也是差强人意吧,刚刚能接受的一个水平。同时在结直肠癌里面,120例的这个结直肠癌数据里面可以看到这个ctDNA的浓度和存活率是呈现一个对应的关系,就是浓度越高的,存活率就越低。





今年1月份cell的一篇文章,来自于华盛达大学的这个研究组,他们发现这种规律,那么通过这样规律来进行肿瘤的溯源。重要的进展还有卢煜明教授2015念发表的这篇文章,也是通过另外一个角度,就是游离DNA的甲基化的研究,全基因组的甲基化的测序来进行肿瘤的溯源,溯源的效果也是比较好。我说比较好,没有特别好,就是因为这个全基组的处理难度还是非常地大,稳定性也不够好,所以要进行肿瘤溯源难度是非常大的。




本来我是跟广州基准医疗的范老师的研究组要他们今年在CSCO会议上发表的一些信息,因为他们正好在外面开会,没有要到,但是我这还是要提一下,就是范老师团队在CpG—island(音)的甲基化,就是选取了100—1000个来进行外周血游离DNA的甲基化检测。通过这个甲基化状态能够区分不同的肿瘤来源,这个是我个人认为比较好的一个应用的方向。就是更smart一点。仅仅代表我个人的观点,在未来的应用上可能会更有前景一些,因为稳定性各方面也更好一些。我们也期待他们的进展吧。




游离DNA的四个重要应用方向


(1)检测药物反应

游离DNA的一个重要的应用方向就是检测药物反应,这个刚才其实我有提到一个基本的概念。2008年那篇经典的文章就是讲这个化疗,随着化疗的不同的阶段,通过单个基因的游离DNA的突变,定性、定量地检测能否检测到病人对手术和化疗的响应,这个同时也是Guradant health他们今年在ASCO会议上公布的数字,就是相对传统的组织类的检测状态,游离DNA基本上都能够检测到,同时如果没有办法获取到组织,那么游离DNA的检测,NGS检测也能够增加42%的标志物。





(2)耐药跟踪

这个游离DNA的ctDNA的检测,另外一个优势就是能够追踪这个耐药,这个可能也是现在游离DNA的应用里最火的一个方向。在肿瘤形成的过程中,它最早可能对药物特别是对化疗药物,超过一半的人对化疗会有response,就是会有反应,但是这种反应可能在很快就会出现耐药的情况。一旦耐药,肿瘤就又复发了。




这个是一个典型的例子。就是靶向药物的使用,随着第一代药的使用到一定的时期就会耐药,耐药之后通过游离DNA的检测来监控这种耐药突变的出现。那么对临床提供指导,那么换第二代,我们可以换更新的药物来进行治疗和控制,治疗肺癌也是非常经典的,我这就不再赘述了。




这里需要强调的就是,目前来看游离DNA的检测在这点上基本上是可以代替传统的活检的。通过ddPCR方法对180例的肺小细胞肺癌患者进行耐药检测,我们可以看到这个PPV还是非常高的,灵敏度我觉得是可以接受的一个范围。




这一篇nature review就是另外一个纬度了,它讲的就是T790M就是一个EGFR耐药的一个位点。同时它的耐药位点在它的上游,就是C797S这个耐药位点的出现,如果只是通过点突变的方法来进行检测的话,那我们可能只能知道突变的存在。那么如果通过NGS的方法,其实我们如果一条DNA分子上既有C797S,又有T790M的话,那么其实知道这个就是来源同一个细胞的、同一段DNA的耐药。那么如果它是来自不同的细胞的DNA,可能药物还是可以再继续用的。




(3)疾病残留

刚才前面有一个讲术后两个小时,游离DNA就基本上消失了,如果没消失可能证明这个切得不够干净,那么治疗的时候也是一样,对化疗不同的response可能就证明了这个治疗的情况。在二期的结直肠癌的里面ctDNA的状态比影像学的复发要更早,甚至比传统的CEA的检测要更加地灵敏。





(4)早诊

早诊这个方向上呢,现在也有很多的公司在这一方面努力。首先一点就是ctDNA的含量跟肿瘤有很大的关系。这个我记得是一个研究组,他们是一个肿瘤样本库,我们做了游离DNA的提取。正常人,就是健康的志愿者他们的游离DNA的含量每毫升在7.4纳克,但是对肿瘤病人来讲平均就是20.3纳克,就是肿瘤病人的量明显地高于正常人,但是这个也存在个体差异,有些正常人的含量也挺高,特别是我们亚洲人。我知道几个公司在做这方面的差别,个体差异都挺大的,可能跟我们的提取方式也有关系,但是这个确实有可能未来会成为筛查的一个指标。




那么转移的肿瘤,就是肿瘤突变的含量会越高,突变率也会越高,分期越晚,肿瘤的突变率越高。文章是北大人民医院的研究组在《自然》的子刊上面发表的文章,58例的二期肺癌的液体活检和组织的匹配度是非常地高,我记得超过了70%,应该是一个非常好的数据,也证明了液体活检已经可以在二期非小细胞肺癌的领域里面起到非常好的应用。





那么对另外一个研究,是法国的一个研究组他们做的,他们实际上没有像王老师研究组做的是组织和外周血的匹配。他们选了TP53这个争议也比较大,研究了这么多年,每年还能发表很多篇文章,据说每年还有几千篇文章发表的跟TP53相关的,就做TP53的突变,做正常人和二期的小细胞肺癌患者,123个正常人和51例的小细胞肺癌的患者。发现了在TP53这个突变上还是有比较明显的差异,有显著的差异。这个可能也是未来一个做早诊或者做早筛的一个基因的指标。





这个PPT就是我总结前面这些早诊、早筛的研究之后的一些思考吧。就是如果我们再往看,刚才的这两篇文章都是在二期,如果往一期或者早期、超早期去提的话,那么这些时期ctDNA的特征会是什么?健康下降和癌前病变的ctDNA的特征又是什么?或者是cfDNA的特征又是什么?这也就是提出了一个基线计划的重要性。我们都知道最近很多公司在推cfDNA的基线计划,实际上美国也有很多尝试。




我们在思考这个问题,肿瘤这么复杂,那么我们需要多大样本量来做这个基线计划,才能够达到或者对普通人的癌症筛查提供指导,那么我们要在一个什么样的分辨率下面去收集这些数据。刚才我们看到它的平均都在千分之四,也就意味着我们的检测技术必须在千分之一,就是低于千分之一的检测灵敏度下面才有可能检到有意义的数据。比如说我们可能需要万分之一、十万分之一这样的检测灵敏度,或者说对肿瘤突变频率在千分之一、万分之一、十万分之一这样的下面去检测。那么我们需要多少种肿瘤的基线计划,因为每种肿瘤都不一样,对吧?我们可以前面有几个研究,15种也罢,14种也罢在肿瘤里边它的突变的含量都不一样,这个可能每一种肿瘤我们都需要一个基线计划。




那么我们怎么能组织合理的基线计划,这些都是对基线计划本身的很大的挑战。其实也不是不能做,或者说在国际上其实有很多的尝试,我们知道来自于Illumina这个测序仪垄断商的或者说主要的测序仪供应商,他们在今年年初founding了一个公司,两亿美金。他们启动了这样一个所谓的基线计划,就是504个基因,大于六万倍的覆盖深度,对504个基因所有序列进行测序。那么选择14种高发的、高致死率的实体瘤,大于7000个的肿瘤患者,同时进行3000个无肿瘤的对照检测。他们的日程表、时间表是在2020年以前完成这些计划。你能看得出来这是多么大的工程,因此就一万人的志愿者搜集本身可能包括而14种肿瘤的鉴定就是一个不小的工作。那么测序六万倍覆盖度504个基因,基本上是要100个G的数据,那么这一个病人100个G的数据的分析、处理,一万个病人再集合在一起这种整合的分析,可能是非常庞大的一个工作。所以两亿美金也不够花,可能要花更多的钱才有可能做完这个工作。


ctDNA的检测技术


我们说这个ctDNA的检测技术,我们所知道的,其实是由我们所看到的东西决定的。那么技术也就是我们的眼睛在这些领域里面,帮助我们看到的方式。分子生物学的发展尤其如此,遗传学、分子学的发展是随着工具的发展来发展的。




我们可以看到其实最近几年液体活检的爆发也是NGS的技术的爆发所引起的。在主要的ctDNA点突变技术里面Ice cold PCR、ARMS PCR、ddPCR这些技术都有各自的灵敏度和适用范围。目前来讲在ctDNA的检测上应用比较多的可能还是ddPCR这项技术。我们也有ddPCR的平台,可以达到万分之一的灵敏度,这基本上也是作为一个基本的要求。


通过高通量测序来检测ctDNA的话比刚才点突变的技术就要更进一步,因为点突变一次可能只能检测几个点,特别是像ddPCR一次可能要用几十个纳克的游离DNA,那么如果10ml血的话可能检测3—4个点已经到极限了。那么对肺癌,我们可能需要至少检测4个以上的点,那就很难通过ddPCR的方法了,耐药还是没问题,但是如果一开始检测(很多位点)就非常难,NGS技术可以说在这个点上是不可取代的。




NGS技术,测序那块基本上都是用Illumina或者life(音)的平台那么在前面的样本制备、游离DNA的富集这个技术上还是有很多发展的。


很多不同的技术发展出来,那么我这里列出来几种代表性的技术,第一个是我们自己的技术就不多说了。那么下面是CAPP—seq可能是现在主要的几家国内的液体活检公司在用的技术。那么Firefly是安可济的一个技术,单链环化的技术。cSmart技术是Berry genomics的技术,Duplex sequencing其实这个技术发表了挺长时间了,但是一直没有往商业化。但是我知道很多公司也在用这个技术,Guardant health的一个技术跟这个稍微有点像,但是也有一点区别,后面也会有一个基本的原理上的展示。


这个是五种基于UID的ctDNA的检测技术,大家简单看一下,以及三种环化技术,包括cSmart、safe seq和Firefly,制备之后后面都要接一个DNA捕获,那么安捷伦(音)捕获平台基本上是绕不过去的。富集这一块life刚刚发布了它的UID PCR技术,这个技术也很有特点,就是两轮PCR加上一个UID合成能够检测千分之的这个突变频率。技术我们叫U—CAP(音)就是单链的连接扩增的技术。单链连接扩增技术能够更好地还原游离DNA的状况,这个也有几篇文章发表了,就是它的覆盖度可能比双链连接的技术要更好,就是比前面那几种通过双链加UID的方法要更好一些。





这里简单算一个账,10ml外周血里面大概能够提出来100个纳克的基因组DNA,那么它能代表2万—4万个拷贝的基因组,也就是细胞来源的基因组。那么通过样本制备的过程,ddPCR直接检测,所以它肯定能达到万分之一,对吧?那么连接的方法,连接效率90%,后面的连接效率是50%左右,那么捕获效率大概90%的话,基本上也能到万分之一。那么环化(音)这些技术也基本上能够达到万分之一的检测灵敏度。




ctDNA的研发方向包括以下这几个方向,就是通过全基因组的测序在做肿瘤筛查,那么通过游离DNA的降解或者甲基化这些指标进行肿瘤的溯源以及通过核小体这个位置,promotor测序的方法能够检测到基因的表达,以及通过甲基化指标进行肿瘤的早筛,通过游离DNA的溯源来进行组织损伤的评估。






元码基因:做10k的下一代液体活检品牌


我们自己画出来了一个液体活检未来发展的趋势,就是从10ml血里面,2万个拷贝cfDNA其实能够达到万分之一的频率的突变的检测的灵敏度,同时能够从点突变特定区域、全基因组结构变异、全基因组层面能够进行液体活检,最全面达到液体活检的覆盖度。可能的方向就是我们的TCR,最近也有一个做TCR的公司,我记不得公司的名字,raising到了几千万的投资,在做TCR这块的检测。血小板RNA这两年发展也非常快,虽然我们尝试了,但是还是比较难做的,但是未来可能也是一个发展的方向,所以对基因结构变异的检测这两个方向会有非常好的应用。




简单介绍一下我们(元码基因)在做什么——液体活检子品牌,我们希望做到四纬的这种液体活检,也就是“四定”:“定性、定量、定位、定序”的液体活检。能够实现万分之一灵敏度,这是我们一直在努力的方向。


UCAP技术克服了ddPCR的10ml血只能检测4个点这个极限,就是进行一个线性扩增,那么这样可以做更多的点的检测。UCAP技术能够实现定性、定量的检测。我们的DeCAP就是通过游离DNA降解,利用游离DNA降解规律来设计探针的方法能够实现肿瘤的溯源和大量突变的监控和检测。推出了从肺癌的小PANEL 9基因的PANEL到38基因的所有综合用药的PANEL,到143个基因跟NCI—match所选用的143基因对标的所有做临床实验的,已经在临床实验阶段的肿瘤的用药的PANEL,以及一个我们叫全景的443个基因的肿瘤用药PANEL,可以说在PANEL这块检测上我们已经相对覆盖比较完整。




同时,我们也开始提供全基因组的拷贝数变异的肿瘤的筛查以及全基因组和全外显子的液体活检,进行肿瘤溯源的这么一个服务。我们也是建立了标准的符合临床要求的实验室,以及我们通过了卫计委的肿瘤分子病理相关的室间质评。目前,我们参加的包括遗传病的、肿瘤分子病理的以及NIPT的都是满分通过。目前我们建立了平台,包括传统的分子病理的高通量测序的以及CTC和高性能计算的平台。


同时,我们也有很多合作伙伴,能力利用好同行的优势,把我们自己的技术发挥到极致。我们在大数据这一块,跟北京计算中心进行了战略合作,以实现肿瘤大数据的本地化,数据驱动的方法为肿瘤患者提供更好的解读。


最后谢谢大家,今天就这么多,好像有点超时了。


问答环节


1、群友:越来越多的人开始认为基因测序应用领域的下一个爆发点将是肿瘤市场,您是否认同?


田埂:我是非常认同的,就是肿瘤领域会是下一个真正意义上的爆发点,因为我可能也是说了,我的博士专业就是肿瘤基因组学,那时候我们生物芯片来做肿瘤的基因组的DNA拷贝数变化,那个时候发现芯片的分辨率还是不那么好,当然技术也在不断地完善。那么后来我们用外显子测序的方法来做这个肿瘤的研究。一个外显子测序要数万块钱,从十万块钱开始,到现在也得数千块钱,而且不能做非常深度的测序。那么现在这种PANEL越来越成熟,PANEL测序越来越成熟,而且数据也越来越好,那么我想它已经在让病人实实在在获益,所以未来我想每一个病人都应该先检测一下PANEL然后再决定他的治疗。


2、群友:田博士,液体活检目前在医院推广的难点在哪里?


田埂:液体活检目前在医院推广难度在哪里?这实际上是一个系统问题。首先就是我们的液体活检还没有任何一个产品是真正有注册证的。那么好像只有艾德有一个有证的EGFR的检测是可以做血检,在我看来也不能算真正意义上的或者说完整意义上,我们现在说的这个液体活检。


首先在监管上来讲是一个灰色地带;那么第二点支付上来讲没有医保的支付;第三点就是临床大夫的认可也需要一个过程。所以我想这三点可能是目前临床推广最重要的三个难点。


那么病人的接受程度在我看来,反倒是其次的,因为病人只要是大夫讲明白,病人一般都能接受。因为毕竟它是一个很好的方法嘛。


3、群友:感谢田老师分享,想请您谈谈液体活检行业的政策风险


田埂:政策风险,这个是一个非常好的问题,也是一个非常难回答的问题。因为在美国现在有证的也只有一个罗氏那个cobas,我记得是今年拿到了证,FDA的注册证。整个测序行业是没有证的,但是美国那套监管体系它是那种LAB认证是可以的,在中国目前肿瘤这整个大方向都没有一个有证的,所以说实话,如果要关停整个行业随时都有可能被关停。就像当年NIPT被关停一样的风险,就这么大。


而且卫计委和CFDA这两条线的监管好像还不太一样。卫计委有一个肿瘤的试点实验室,包括北京的肿瘤医院这些都是有试点实验室资质的。但是液体活检相当于肿瘤NGS这一块的一个应用方向吧,所以理论上来讲在中国还是有一些机构或者医院能够提供从卫计委角度和政策的服务的,但是实际上来讲确实这个是很难讲的一个问题。


我们相信随着液体活检技术逐渐地推广,只要临床上的认可度越来越高,它迟早会被体制所认可的,这个需要同行大家一起努力,包括工业界的,包括临床医生的,包括基础研究者一块儿努力。我相信这三年到五年的时间,我们这个行业一定会在政策上来讲规范起来。


4、群友:您认为液体活检行业的发展瓶颈是什么?


田埂这个也是一个很好的问题,在我看来,这是整个基因组医学或者精准医学领域发展的瓶颈跟液体活检行业发展瓶颈是一样的,就是一个是上游的科技发现没那么快,虽然我们技术发展得很快,但是在科学发现没有(跟上)的情况之下很多应用是不能开始的。典型例子就是肿瘤的早筛和早诊,对吧?因为我们中国的这些企业的基线计划更重要的是想要把肿瘤的液体活检,从目前的用药、临床指导变成未来大众的肿瘤的一个筛查,健康体验筛查项目。


这一块其实是有赖于基础研究的发展,科学研究清楚了肿瘤发展的机制是什么,在什么时候释放多少ctDNA到血里面去,首先把这个问题回答清楚,这是一点。


第二点,就是在中国这个行业发展的瓶颈是什么,第一个就是测序仪,最重要的就是测序仪,我们现在没有特别好的测序仪,华大的那个测序仪发展得很快,但是目前来讲还很难跟Illumina的测序仪进行质量、效率上的比较。测序仪的灵敏度特异性其实决定了这个行业的发展线路,如果掌握不了硬件这块,那么这个整个行业都会受制于人,受制于美国的测序仪公司的测序仪的发展。当然在自由世界里面,我们说人类掌握的技术是最重要的。抛开民族主义不说,硬件的发展也是这个行业发展的瓶颈。


第三点,就是我们说管理体制,刚才说的政策风险也罢,监管体制的风险也罢,以及支付方,就是目前是肿瘤病人作为支付方。一个肿瘤病人,如果说最早做一个组织的分子病理或者一开始就做液体活检,那么随着他的化疗的进展、治疗的进展,可能要做数次。如果(检测)一次现在市场市价都在一万以上的,(按)这样一个价格来讲,检测费用就要几万块钱,加上治疗费用那又是一大笔钱。


支付方的问题如果解决不了的话,这个行业发展也不会那么快,可能需要保险公司、医保能够介入的话,那我相信这个发展速度会非常快。


还是就是人才上的缺失,目前来讲研发的人才、管理的人才在这个行业都是比较稀缺的资源,这些是华大成为黄埔军校的一个主要原因,如果说学校多,那么可能华大系的就没有那么重要了。之所以这个行业华大这么重要,是因为培训机构确实太少了。


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文|田埂

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