独家丨单细胞检测在优生领域将大显身手，但标准缺失严重掣肘行业发展

整理丨张楠

11月23~24日，2017中国精准医疗产业领袖峰会暨第七届Bio4P中国医健创新创业大会在杭州盛大举行。24日上午，在单细胞诊断论坛上，国家辅助生殖与优生工程技术研究中心、山东大学附属生殖医院分子遗传室主任高媛作了精彩报告。

山东大学附属生殖医院分子遗产室主任高媛

以下为嘉宾演讲全文整理：

今天我主要围绕单细胞基因检测在优生领域中的应用和大家作下分享。随着二胎政策放开以后，很多的夫妇会提前到医院咨询能否生一个健康的孩子，这也促使生殖领域工作者不仅要帮育龄夫妇解决生育的问题，同时还要帮助他们生育健康的孩子。

生殖细胞在体外受精形成胚胎之后，如何确定这个胚胎健康与否？通过胚胎植入前遗传检测可以做部分判断。当未见异常的胚胎移植到母体后，在分娩前还有一道屏障，就是进行产前诊断。出生后还有一个新生儿筛查，以上这就是目前预防出生缺陷发生而进行的三级预防，分别在孕前、产前和新生儿三个时期进行监控的三个点。

单细胞检测在生殖领域当中如何实现应用？目前主要是在胚胎植入前遗传学诊断中，也就是所谓的三代试管中应用的最多。

胚胎植入前遗传学诊断，（Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD）是指在体外受精过程中，对具有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析，以选择无已知遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的诊断方法。这种方法可有效地防止遗传性疾病患儿的出生，是产前诊断的延伸，也是遗传学诊断的新技术。

胚胎植入前遗传学筛查，也就是PGS（preimplantation genetic screening，PGS）是对早期胚胎进行染色体数目和结构异常的检测，筛查出未见染色体异常的胚胎植入，从而提高着床和妊娠的成功率。在临床上，PGD和PGS整个流程技术基本一致，不同地是PGS是针对全基因组水平上的染色体检测，主要是染色体层面上的筛查。而PGD则是针对有非常明确问题的胚胎，比如染色体的数目或结构异常、明确的单基因遗传病都可以通过PGD对胚胎进行筛选。但PGS在临床上应用更加广泛。对于PGS，欧洲ESHER有PGS适应征的相关指南，其中规定36岁以上的妇女，三次以上的优质胚胎移植以后着床失败的，以及多次胚胎移植总移植胚胎数大于10次着床失败和3次反复自然流产等临床指征的情形适用。

PGD/PGS流程中，活检实际上就是单细胞的收集。在卵裂球期（D3）胚胎进行活检，一般是单细胞，而在在囊胚期（D5-6）进行活检则可以取出少量几个细胞，一般都不足10个细胞。活检到的细胞有一定的随机性，胚胎在发育的过程中也有自我修复特性，所以对于PGD/ 48 31872 48 15289 0 0 4079 0 0:00:07 0:00:03 0:00:04 4079PGS一定要进行产前诊断。

目前行PGS/PGD检测的技术有多种，比如FISH，多重巢式PCR，aCGH及NGS等。随着技术的发展，aCGH和NGS越来越多地应用在临床PGS的检测中。而单细胞全基因组扩增技术对aCGH和NGS技术上的单细胞基因检测影响很大，目前在PGS/PGD中常用的单细胞扩增技术有DOP-PCR（简并寡核苷酸引物PCR）、MDA（多重置换扩增技术）、MALBAC（多次退火环状循环扩增技术）等。有研究显示，比较几种基因组扩增技术，DOP-PCR 和MALBAC 方法在拷贝数变异（CNV）的均一性上要好一些。MALBAC方法对GC含量高的序列有扩增偏好，但通过生物信息学方法矫正后也可准确地分析拷贝数变异（CNV），对于GC含量较高的物种可以选择该种方法。MDA方法操作简单，扩增随机，对GC含量没有偏好性，在SNP的研究中具有优势，特别是在样本量较少的情况下。目前，越来越多的单基因遗传病PGD也开始应用NGS的手段来检测分析，因此在做PGD/PGS的时候一定要注意，胚胎到底要做什么分析，在明确分析靶标和后期的检测技术后，再来确定最合适的单细胞扩增技术，否则会给后期检测带来很多麻烦。

举个临床应用的实例，脊肌萎缩症是中国人当中携带率非常高的疾病，每40-60个中国人中有一个携带者，它是一种影响肌肉运动控制的遗传性疾病，约95%的症状由SMN1基因外显子7的纯合缺失引起。我们用传统的STR位点分析结合MLPA方法进行了家系检测，明确家系的致病突变后，按夫妻要求行PGD，后又通过NGS的方法分析胚胎，两种方法结果一致。在我们实验室，只要明确单基因遗传病的致病突变都能通过传统的多重巢式PCR手段完成PGD的胚胎筛选，同时大多数的单基因遗传病也都可以通过NGS实验检测。

另一个应用单细胞检测在优生领域的应用是无创产前检测NIPT。目前应用最广泛的NIPT是利用母体外周血当中胎儿游离的DNA来检测，但此检测中毕竟存在大量母体DNA的干扰。早在1969年就发现在母体外周血当中存在胎儿游离的细胞。目前也有学者在尝试用无创的手段从母体中筛选出胎儿细胞行遗传学检测，根据胎儿细胞的来源主要有三类，分别是母血当中胎儿的滋养层细胞，有核红细胞，母体子宫颈滋养层细胞。

整个过程中最大的难点是对于单细胞的鉴定和分离，因为母源外周血当中，有核的红细胞比例非常低，一毫升可能只能分离出一个细胞，分离很困难。其次是胎儿细胞的鉴定，如何利用特异的marker对分离出来的胎儿细胞进行鉴定，再进行相应的检测。

对比胎儿的游离DNA和胎儿的细胞，胎儿细胞的分离和鉴定相对更复杂，但是比胎儿DNA的应用更广泛和直接，未来也许会应用于诊断，而胎儿游离的DNA主要还是筛查。

目前来看单细胞检测在临床中的实际问题有哪些？希望给企业界朋友一些参考。我们在做PGS时发现，同样一个样本在不同的平台上检测后的结果会不同。所以如何统一分析的标准很重要，这也引出了PGS目前所面临的问题，准确性问题、局限性问题、安全性问题，都是患者和医生最关心的问题。另外是性价比，目前高通量测序成本在逐年降低，但是临床应用成本还是比较高，患者也一定会考虑成本问题。

目前，应用于PGS的平台包括华大（BGISEQ-500）、Illumina（MiSeq）、Illumina（NextSeq 500）Illumina:（Karyomapping 芯片）、Thermo Fisher（Proton）、Thermo Fisher（PGM）、aCGH （芯片）等。

最后谈下单细胞技术的进展，2017年Science上发表了新的单细胞扩增技术LIANTI，能利用更为均一的线性扩增，提高单细胞CNVs检测的分辨率（from 1Mb to 10kb），降低单细胞SNVs检测的假阳性率。此外目前平衡易位携带者筛查在临床上的应用还受到限制，虽然已有相关文章发表，但在临床大规模应用还有很多附加条件。

针对单细胞基因检测在优生领域中的发展方向，还有一些新的尝试，比如通过数字PCR（ddPCR）手段进行唐筛，相比NGS成本更低、灵敏度更高还可以定量。

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