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学术笔记

基因编辑灵长类动物模型在神经科学研究中的应用 

                                 报告人： 陈永昌教授

                                   整理人：吕雪静

       2018年9月27日，昆明理工大学灵长类转化医学研究院陈永昌教授，应复旦大学脑科学研究院朱剑虹教授的邀请，在复旦大学枫林校区治道楼8楼会议室做了一场题为“基因编辑灵长类动物模型在神经科学研究中的应用”的报告。陈永昌教授的主要研究方向是利用基因编辑构建人类疾病的灵长类动物模型，通过遗传学及综合行为学分析探究疾病的发病机理，探索治疗方法并评价有效性及安全性。在本次讲座中，陈永昌教授从灵长类动物模型在研究神经系统疾病中的必要性与优势的角度解释了为何要建立灵长类动物模型，以及动物模型建立时使用的方法。此外还介绍了研究中心将最新的基因编辑技术应用到模型建立的一些研究实例。

建立灵长类动物模型的原因和方法

人类神经系统的发育精密而复杂，神经系统发育异常会导致一系列的疾病，而缺乏可靠的疾病模型阻碍了对发病机制的研究。生物和医学研究中最常用到的模型动物是啮齿类的小鼠，但其神经系统的发育、结构和功能均与人存在显著差异，线虫、果蝇、斑马鱼等进化上与人距离更远的动物模型差异则更为巨大。这是导致目前神经系统疾病药物开发成功率很低的原因之一。而灵长类动物在胚胎发育过程、基因组、大脑的结构等方面和人类很相似，可以弥补其他动物作为疾病模型的不足。

建立灵长类动物模型疾病模型的方法包括药物诱导、手术损伤，克隆动物转基因等。陈永昌教授所带领的团队主要通过基因编辑技术（TALENs，CRISPR等）对灵长类动物的内源基因组进行改造建立神经疾病模型。

瑞特综合征（RTT）灵长类动物模型

瑞特综合征（RettSyndrome, RTT）是由位于X染色体上的MECP2基因突变导致的神经疾病。由于男性胎儿多在胚胎期流产，因而患者多为女性。RTT一般在出生后6-18个月发病，早期有自闭症的表现。2001年已有团队报道建立RTT小鼠模型[1]，并发现了部分与病人相似的神经系统症状，但小鼠雄性不致死，雌性不发病，且难以模拟患者高级认知、情绪及精细运动等方面的病症。虽然已有多种RTT相关小鼠模型被广泛研究并催生重要成果，但鉴于以上缺点，仍非模拟人类RTT的最理想模型。陈永昌教授及合作团队利用TALENs成功在猴模型中对MECP2基因进行敲除[2]，并对其基因表达、病理和行为学特征进行了深入分析[3]。他们观察到，猴模型与人相似，雄性胎儿在胚胎期均流产（表1），雌性动物则存在睡眠节律紊乱（图1）、主动社交显著减少、脑发育异常等表征，眼动跟踪模式也与临床患者类似[3]。这些研究证明灵长类动物模型能够更好地模拟人类的RTT疾病，将为进一步疾病治疗的研究提供更有力的支撑。

表1. DMD猴模型出生及突变情况汇总表

图 1. 睡眠节律监测

杜氏肌营养不良症（DMD）灵长类动物模型

杜氏肌营养不良症是一种X染色体连锁隐性单基因突变疾病，男孩更易发病，一般在3-5岁左右发病，骨骼肌逐渐退化，20多岁死于心脏及呼吸功能的退化，发病率约1/3500。目前已有小鼠及犬类模型和一些治疗方法的研究，然而这些动物与人类在遗传背景、肌肉结构等方面有差异，且无法开展精细运动评估。陈永昌教授的团队利用CRISPR/Cas9系统成功构建了Dystrophin基因敲除猴模型（图2），并成功重现了肌酸激酶浓度显著升高、活动量明显减少、及运动障碍等病人中存在的表型[4]。他们后续依托此动物模型开发治疗手段，例如通过AAV病毒载体和Cas9系统进行体内基因修复，或者进行移植具有正常基因的细胞。

图2. DMD猴模型及其肌肉中Dystrophin蛋白表达的Western Blotting分析结果

总结

陈永昌教授通过基因编辑的办法对目的基因进行修饰，从而构建神经系统疾病的非人灵长类动物模型，并从不同的层次监控模型动物的发育和病理进程，包括通过转录组分析基因的变化、在细胞水平研究神经元的发育以及神经网络的形成、在行为水平检测整体动物表型等，从而更深入地研究灵长类大脑的发育，并找寻可应用于人类的有效治疗方法。

最后，陈永昌教授仔细认真地回答了每个老师、同学提出的问题，在同学们热烈的掌声中结束了本次讲座。

参考文献

[1] J. Guy, B. Hendrich, M.Holmeset al. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms thatmimic Rett syndrome[J]. Nat Genet, 2001, 27（3）: 322-326

[2] H. Liu, Y.Chen, Y. Niuet al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgusmonkeys[J]. Cell Stem Cell, 2014, 14（3）: 323-328

[3] Y. Chen, J. Yu, Y. Niuet al.Modeling Rett Syndrome Using TALEN-Edited MECP2 Mutant Cynomolgus Monkeys[J].Cell, 2017, 169（5）: 945-955

[4] Y. Chen, Y. Zheng, Y. Kangetal. Functional disruption of the dystrophin gene in rhesus monkey usingCRISPR/Cas9[J]. Hum Mol Genet, 2015, 24（13）: 3764-3774