学术笔记-哺乳动物视网膜中vGluT3无长突细胞的功能环路
报告人：Jimmy Zhou（周志敏）教授
整理人：杨入祎、陈文浩
审稿人：翁史钧、何苗
2018年9月14日，“神经科学前沿”系列讲座的特邀讲座专家——来自耶鲁大学的周志敏（Z. Jimmy Zhou）教授，应复旦大学脑科学研究院视网膜课题组杨雄里院士邀请，来到复旦大学上海医学院明道楼1311会议室，做了一场题为“Functional circuit of vGluT3 amacrine cells
in the mammalian retina”的报告。
在本次讲座中，周志敏教授为大家简单介绍了哺乳动物视网膜（retina）中的一类非常重要的抑制性中间神经元——无长突细胞（amacrine cells，ACs）的形态与功能多样性，并详细讲解了他的团队如何发现和验证vGluT3型无长突细胞能够同时释放谷氨酸和甘氨酸两种神经递质，并探索其在视网膜信号加工中的功能。
视网膜主要由三层细胞光感受器（photoreceptor）、双极细胞（bipolar cell）、神经节细胞（ganglion cell）在纵向组成兴奋性通路；另外，水平细胞（horizontal cell）和无长突细胞（amacrine cell）在水平方向组成信号调制网络。无长突细胞具有极强的多样性，据目前的估计，种类可达70种以上。
图1 视网膜分层及无长突细胞的基本分类
该类无长突细胞在本世纪初才被发现。它不仅能够释放抑制性神经递质甘氨酸（glycine），还含有Ⅲ型谷氨酸囊泡转运体（vGluT3），具有释放兴奋性神经递质谷氨酸（glutamate）的能力。因此，该类细胞还被称为谷氨酸能无长突细胞（glutamatergic amacrine cell，GAC）。
图2：经免疫组化染色后，vGluT3与GLY出现共定位，说明该类无长突细胞可以产生并释放glutamate与glycine两种神经递质（Johnson et al, J Comp Neurol, 2004）
用全视野蓝光激活vGluT3-Cre/ChR2-YFP小鼠视网膜中表达对蓝光敏感的兴奋性光敏通道蛋白channelrhodopsin-2（ChR2）的GACs，同时使用膜片钳技术钳制神经节细胞层（GCL）的各种细胞进行记录。通过施加L-AP4（代谢型谷氨酸受体激动剂）、ACET（红藻氨酸KA受体拮抗剂）及HEX（烟碱型ACh受体拮抗剂），阻断因视杆（rod）及视锥（cone）感光而驱动的双极细胞及胆碱能无长突细胞的兴奋。在这种条件下，蓝光通过激活ChR2而兴奋GAC时，少量节细胞（位于视网膜内层的输出神经元）会发生反应，其中一种被称为rBSGC（recurrent bistratified GC）的节细胞，在钳制在0 mV（非选择性阳离子通道的反转电位）时有明显的外向电流，但钳制在-70 mV（氯离子通道的反转电位）时没有可辨别的电流。还有另一种被称为OFF αGC的节细胞，则在钳制于-70 mV时具有较强的内向电流，但钳制于0 mV时没有明显的响应。进一步研究表明，在蓝光刺激GAC时，rBSGC的反应不能被CNQX（AMPA/KA型谷氨酸受体拮抗剂）和CPP（NMDA型谷氨酸受体拮抗剂）所阻断，但可以被士的宁（strychnine，能够抑制甘氨酸对神经元的抑制作用）完全阻断，表明其不经过中间无长突细胞的间接传递，而是直接接受来自GAC的甘氨酸能输入。与之相比，OFF αGC上蓝光诱发的反应并未被士的宁所阻断，但CNQX能够很大程度上阻断其反应。单独使用CPP仅能略微降低钳制于-35 mV时的光致电流，而使用CNQX及CPP能够完全阻断钳制于-70 mV及-35 mV的光致电流。上述结果表明GAC兼具释放谷氨酸和甘氨酸的功能。在其突触后的输出对象中，rBSGC接受谷甘氨酸能输入，很少或没有谷氨酸能输入；OFF αGC则正好相反，接受谷氨酸能输入，很少或没有甘氨酸能输入。
图3 GACs释放通过不同途径释放谷氨酸和甘氨酸到不同类型的神经节细胞
运用光遗传学方法，用强烈的全视野蓝光激活vGluT3-Cre/ChR2-YFP小鼠视网膜中GACs表达的ChR2，同时用电压钳将位于GCL的ON-OFF DSGC钳制于−70 mV以记录其兴奋性电流。结果发现，除能诱发一股快速的光致内向电流，还能在30-50 ms的延迟后诱发一连串兴奋性突触后电流。药理学实验显示，代谢型谷氨酸受体激动剂L-AP4（能够阻断从光感受器向ON型双极细胞的突触传递）能够阻断延迟的突触电流，表明它们是由ON型双极细胞的输入驱动的。快速的内向电流反应对L-AP4或L-AP4+ACET（KA受体拮抗剂，阻断从光感受器向OFF 型双极细胞的传递）+HEX（一种烟碱型ACh受体拮抗剂）具有抗性，表明它是由GACs释放的兴奋性神经递质诱发的。此外，这种快速响应在蓝光开始的4-8 ms内被激活，远早于BC介导的视觉响应的激活（光起始后40-60 ms）。接下来，为排除ON-OFF DSGC从少量的非特异性表达ChR2的节细胞的轴突侧枝，或从低水平表达（显微镜检测不到）ChR2的双极细胞接受谷氨酸输入的可能，周教授团队使用双膜片钳技术，同时钳制GAC和ON-OFF DSGC进行记录，确认GAC与ON-OFF DSGC之间存在功能性的兴奋性突触。使用同样的研究策略，还证明OFF αGC能够从GAC接收更强的谷氨酸能输入。（图3）
图3 兴奋型递质从GACs传递到特定突触后靶点
当整个视网膜处于均匀的黑色背景时，rBSGC具有持续的动作电位发放。中心光点（半径100 μm）的闪光刺激能够强烈地抑制光起始和结束时的发放。而当处于均匀明亮的背景时，rBSGC也会产生动作电位发放，这些发放能够被闪烁的中心暗点所抑制。均匀深色背景的移动光条经过时，也会强烈抑制rBSGC的发放。因此，rBSGC可以被认为是一种“均匀性检测器（UD，uniform detector）”。中心光点或暗点刺激对rBSGC发放的抑制，其持续的时间相对恒定，不随刺激自身的时间长短而变化。相比于亮背景上的中心暗点刺激，暗背景上的中心亮点刺激导致的发放抑制结束的更早。rBSGC的发放被光照反差抑制的原因在于，GAC接受此类刺激时对rBSGC产生强烈的甘氨酸能输出，且胞体较大的UD比胞体较小的UD接受更大的电流。（图4）
图4 rBSGCs受反差抑制的特点
使用全细胞电流钳技术，记录明适应视网膜上的GAC，结果表明当使用半径为50 μm的中心光斑作为刺激时，在给光和撤光时均会出现快速去极化，然而用大的光斑（半径1000 μm）刺激时，相同的GAC在给光和撤光时都会出现超极化现象，表明GAC受到周围反应区域的强烈抑制。电压钳记录也进一步证明GAC在给光和撤光时均接受兴奋性和抑制性突触输入。当光斑的半径从50 μm增加到1000 μm时，兴奋性输入大大减少，而抑制性输入则变得更强更短暂，表明其感受野外围存在这样的细胞，它们反馈抑制GAC突触前的双极细胞的兴奋性输出，并直接对突触后的GAC施加前馈抑制。L-AP4能够在中心光点给光时抑制兴奋性和抑制性输入，但是不能阻断撤光时的输入。随后在L-AP4上施加ACET消除了撤光时的兴奋性和抑制性输入，表明GAC接收来自ON和OFF的兴奋性和抑制性输入。当用半径不断扩大的一系列光环进行刺激可发现，GAC存在半径约为100μm的、兴奋性的感受野中心，和半径高达1000μm的、抑制性的感受野外周。尽管兴奋性输入的空间特征在ON和OFF反应间是相似的，但是对于抑制性输入，ON反应的空间范围略宽于OFF反应，表明ON反应相比OFF反应具有更强的广野抑制特性。（图5）
图5 GACs反应区域的特点
最后，周教授将目光集中到视网膜中一类特殊的神经节细胞----自感光神经节细胞（intrinsically photosensitive retinal ganglion cell, ipRGC）。需要补充的是：ipRGCs是哺乳动物视网膜中除视杆细胞、视锥细胞之外的第三类具有独立感光功能的神经元。M1型ipRGC作为一类执行非成像视觉功能的节细胞，还具有对比（反差）敏感性。按是否接受GAC的输入、有否对比敏感性这一功能为依据，可将M1型ipRGC分为两个亚类，其比例接近1:1。根据是否表达brn3b，M1型ipRGC又可分为brn3b阳性和brn3b阴性两个亚类，这两类的比例是接近1:9。可见，不同的分类方法得到的分类结果未必相同。针对这个问题，杨雄里院士提出：随着研究的深入，层出不穷的分类标准导致的分类结果的多样化是否会使未来的研究变得更加复杂，这的确是一个值得令人深思的问题。
通过周志敏教授的精彩讲解，大家学习到了vGluT3型无长突细胞（GAC）的发现过程和最新研究进展，对周教授团队的工作有了更深的了解。周教授团队发现了神经系统中第一例能够同时释放谷氨酸和甘氨酸的神经元GAC。虽然目前单一神经元可以实现两种神经递质的“共释放”的概念已经被广泛接受，但周教授的研究表明，单一中间神经元通过分别向不同的下游神经元释放不同的神经递质，可以介导两种相互独立甚至截然相反的环路功能。最后，周志敏教授详细地回答了每位老师和同学的提问，在带来精彩报告的同时，还与大家进行了深入的交流和讨论。
参考文献：
1. Lee S, Chen L, Chen M, Ye M, Seal RP, Zhou ZJ. An Unconventional Glutamatergic Circuit inthe Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 2014;84: 708–715.
2. Lee S, Zhang Y, Chen MG, Zhou ZJ. Segregatedglycine-glutamate co-transmission from vGluT3 amacrine cells tocontrast-suppressed and contrast-enhanced retinal circuits. Neuron. 2016; 90:27-34.