学术笔记-神经系统发育过程中自发性活动的多尺度成像
报告人：Michael C. Crair
审稿人：张嘉漪、何苗
整理人： 郝湘文、解媛婷、李娜
2018年9月10日，耶鲁大学医学院（Yale University School of Medicine）神经科学、眼科和视觉科学系Michael Crair 教授应复旦大学脑科学研究院张嘉漪研究员的邀请，于复旦大学枫林校区治道楼8楼会议室开展了一场题为“Multi-scale imaging of spontaneous activity in the developing nervous system”的讲座。Michael Crair 教授从“视网膜波介导了视觉环路的形成”、“视网膜波的动态特性”及“多尺度成像”三个方面阐述了早期神经系统发育过程中产生的自发性放电活动对视觉神经环路发育的指导性作用。
视网膜自发性活动（retinal wave）的产生与作用
研究视觉系统的经典实验表明，在视觉功能发育的关键期，视觉经验对于塑造神经环路起着重要作用。但在发育早期（动物未具有视觉经验之前）的哺乳动物神经系统中，部分神经环路就已经形成，比如双眼分离和拓扑投射。视网膜和视觉系统中自发性的放电活动是这些发育早期神经环路形成的重要因素之一。视网膜上的自发性放电呈现一种大规模且随机的波形模式，即“视网膜波”（Retinal waves）[1][2]。小鼠的视网膜波存在于胚胎期到P20左右，很大程度覆盖了视觉系统的发育过程，外侧膝状体（dorsal lateral geniculate nucleus, dLGN）和初级视皮层（primary visual cortex, V1）中也存在自发神经活动。
Crair 教授向我们介绍了在小鼠发育的3 个阶段由不同的神经递质介导的具有不同时空特性的视网膜波，并着重介绍了发育的第 2 阶段，即小鼠出生后10 天内（P0-P10）的视网膜波(图 1）。最近的实验已经证明，第 2 阶段视网膜波由含有β2亚基的烟碱型乙酰胆碱受体（β2-nAchR）介导，其时空特性通过突触传递到中枢视觉系统。在此基础之上 Crair 教授向我们阐述了该阶段的视网膜波在视网膜神经环路精细化（visual circuit refinement)、视网膜拓扑图（retinotopy）的形成以及双眼特异性分离中所起的作用。
图1 小鼠不同发育阶段的视网膜波
体外药理学操作已经证明，出生一周的小鼠中的自发性视网膜波依赖于 β2-nAChR 的表达，故Crair 教授利用两种 β2-/- 突变体小鼠作为研究模型：视网膜特异性的 β2-nAChR 突变体小鼠（Rx-β2cKO）和全身 β2-nAChR 突变体小鼠（β2KO）[3]。在体记录表明全身β2-nAChR 突变体小鼠（β2KO）中自发性视网膜活动明显减少且波动显著中断；利用成像技术以及解剖学示踪等技术发现在 Rx-β2cKO（P3）的视网膜中自发性视网膜波的频率也会明显减少（图2）。
接下来Crair教授介绍了自发性视网膜波对视网膜拓扑图精细化的作用：（1）利用成像技术发现 β2 KO小鼠中的视网膜波频率和持续时间明显减小，传播速度明显增大，同时视网膜拓扑图的精细化程度大大降低；（2）利用Rx-β2cKO 突变体小鼠进行的实验发现：对视网膜上不同区域进行选择性敲除能够终止对应区域的视网膜波，视网膜波消失的区域，其视网膜拓扑结构的精细化过程也被破坏[1]。
对β2 KO进行 CPT-cAMP 处理（向 P2-P6 小鼠的玻璃体施用2mM CPT-cAMP)，发现上丘（SC）与背外侧膝状核（dLGN）中眼特异性分离大大增强（图 3），说明了自发性视网膜活动对眼特异性分离是必要的。最后，Crair教授总结： SC和 dLGN 发育过程中自发性视网膜波对视网膜拓扑图的形成和眼特异性分离起到了重要的作用。
图 3. 外源施用 CTP-cAMP 后 SC(左）和 dLGN(右）中眼特异性分离增强
视网膜自发性活动的动态特征
Crair 教授应用双光子 Ca2+成像技术对小鼠自发性视网膜活动波开展研究，发现其具有方向性，且随发育动态变化。小鼠出生后 7 天内，自发性视网膜波并没有明显的朝向。但是，在第 8-12 天（P8-12），自发性视网膜波却表现出较强的方向性。超过这个时间窗口（P13-17），自发性视网膜波的方向性减弱甚至消失。与此一致，通过光遗传学的手段在剥离的P6小鼠视网膜中诱发出的视网膜波并没有表现出方向性，而在 P10小鼠视网膜中诱发的视网膜波则具有和自发视网膜波相同的方向性。
有趣的是，自发视网膜波的方向与动物自然运动的光流（optic flow）引发的钙活动具有相同方向。Holly Cline实验室的Hiramoto Masaki 等人通过实验发现，在出生后立刻接受外界视觉刺激的模式生物爪蟾中，其视网膜拓扑图的精细化受到自然光流驱动的视网膜活动的调节（图 4）。视网膜拓扑图的精细化是一个动态过程，该过程可以通过视网膜细胞轴突或者树突的位置变化来观察。当自然运动方向（A→P）与光流方向（视觉刺激的方向）一致时，会促进视网膜拓扑图的构建，相反时（P→A）则阻止其构建[4]。其次，外源性使用抑制性神经递质 GABA 和 Glycine 可以导致视网膜波的方向性消失，表明视网膜波的产生可能依赖于某些抑制性的中间神经元（Michael Crair 教授实验室未发表数据）。以上结果说明：自发性视网膜波对视网膜拓扑图的建立具有指导性作用，且有助于建立视网膜中固有的方向选择性回路。
图4 视网膜拓扑图的形成受光流方向的调控
多尺度成像
Crair 教授还介绍了结合双光子 Ca2+ 成像与功能性磁共振成像 fMRI开展的多尺度成像研究，Crair教授通过介绍他课题组开展的未发表研究，对如何实现功能性磁共振装置中同时进行全脑或局部脑区钙成像的装置设计进行了详细的介绍。Crair教授对比了双光子 Ca2+ 成像与血氧水平依赖性（Blood-oxygen-level dependent, BOLD）fMRI成像两种方法，对视网膜波的成像结果显示结合这两种方法开展的多尺度成像研究是很稳定可靠的（未发表结果）。之后，Crair教授对未来的研究前景进行了展望：检测不同的神经元集群对视网膜波的影响，例如中间神经元；检测在发育的过程中视网膜波的变化；检测视网膜中功能性连接的方向性等问题。
总结
最后，Michael C. Crair教授热情详细的回答了老师、同学们提出的问题，讲座在大家热情的掌声中圆满结束。
Crair教授此次的学术报告简单介绍了早期发育中自发性神经活动与视网膜波，利用β2-/-突变体小鼠阐明了视网膜的自发性活动对视网膜图的精细化以及视网膜拓扑图的形成的重要指导作用，并系统的介绍了多尺度成像在未来研究中的应用。通过本次讲座，我们对视网膜波有了一个详细的认识，同时Crair教授的研究思路也为我们以后的科研工作提供了很好的指导。
参考文献
[1]. Burbridge TJ, Xu HP, Ackman JB, et al. Visual circuit development requires patterned activity mediated by retinal acetylcholine receptors[J]. Neuron. 2014, 84(5):1049-64. .
[2]. Arroyo DA, Feller MB. Spatiotemporal Features of Retinal Waves Instruct the Wiring of the Visual Circuitry[J]. Frontiers in Neural Circuits. 2016;10:54. doi:10.3389/fncir.2016.00054.
[3]. Xu HP, Burbridge TJ, Chen MG, et al.Spatial pattern of spontaneous retinal waves instructs retinotopic map refinement more than activity frequency[J]. Dev Neurobiol, 2015, 75(6):621-40.
[4]. Hiramoto M, Cline H T. Optic flow instructs retinotopic map formation through a spatial to temporal to spatial transformation of visual information[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(47): E5105-E5113.
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