Clinical Chemistry发表新型产前唐氏综合征cfDNA筛查方法，检出率可达95.9%

唐氏综合征又称21-三体综合征，指21号染色体由正常的2条变成了3条，是小儿染色体病中最常见的一种。唐氏综合征患儿以发育迟缓、智力低下为主要特征，伴有多器官发育障碍或畸形。在产前对胎儿进行筛查、诊断，能有效降低唐氏综合征患儿的出生率，提高人口质量。目前，唐氏综合征的筛查已经从单纯基于产妇年龄，发展到结合使用产妇血清和超声标记，在增加了检出率的同时维持或减少了假阳性。这一策略也扩大了对其他不常见但严重遗传疾病的筛查，例如18和13三体症。目前，游离细胞DNA（cfDNA）检测方法以更高的检出率和极低的假阳性率被应用于唐氏综合征的筛查。但基于cfDNA的筛查方法需要复杂的生物信息学和分子专业知识技术来实现，并需要在严格的环境控制前提下进行检测，运行和维护成本较高。如果cfDNA筛选能够变得更加自动化，在不牺牲性能的情况下减少对复杂技术和环境要求的依赖，其就可以为当地有经验的小型筛选实验室提供服务。在此背景下，一种基于滚环扩增（RCA）的非测序、非PCR方法被商业开发。

近日，来自美国布朗大学的研究团队在Clinical Chemistry上发表了题为“Assessment of a Simplified Cell-Free DNA Method for Prenatal Down Syndrome Screening”文章。研究团队训练了一种简化的基于RCA的cfDNA方法，并通过检测妊娠10至20周的妊娠血液样本和已知结局来评估该方法对常见三体的筛查性能。研究结果显示，该方法可以提高检测水平、实现低故障率和快速报告。

文章发表在Clinical Chemistry上

2017年10月至2019年5月，研究团队在16个不同的地点设立了试验点，多名妊娠10至20周的孕妇进行了注册、登记，并提供了知情同意书、相关信息和2-3份血液样本。最终，共有2,396名孕妇纳入研究，其中既有一般妊娠人群，也有高危妊娠群体，以获得足够数量的常见三体（图1）。一些试验点通过临床cfDNA在一般妊娠人群中进行初步筛查；另一些试验点则为高危妊娠人群提供诊断性检测。此外，研究团队对所有纳入研究的孕妇进行了RCA检测。

在一般人群队列收集的2213个妊娠结果中，常见三体综合征的患病率为3.6%。研究团队在高危人群队列中筛选出122个怀有常见三体综合征胎儿的孕妇，用于计算检出率。来自临床cfDNA检测的胎儿DNA片段在高危组中较少报告，且显著较低。

图1. 研究人群的描述。

结果显示，常见三体的RCA检出率为95.9%，略低于预期。18和13三体的检出率分别为96.6%、62.5%。上述122例孕妇中，108例有临床胎儿分数报告，8例低于4%。

总体假阳性率为1.00%，21号、18号和13号染色体的特异性假阳性率为0.23%、0.68%和0.09%。其中，三分之二的假阳性发生在18号染色体上。重复测试后的测试失败率为0.04%。

表1. 两个队列的妊娠结果与妇婴医院（WIH）实验室、临床实验室的cfDNA结果。

为了尽量减少由标准差（SD）决定的运行变异性的影响，研究团队将21号和18号染色体SD“上限”设置为0.40%，13号染色体的SD“上限”设置为0.60%。计算每个目标染色体的z值时，使用实际的SD或有上限的SD，以较低者为准。当超过上限时，每个三体的中位数z评分都较低。结果显示，总检出率在有上限与无上限的情况下分别为94.6%和97.1%（P = 0.40）。（图2）

此外，研究团队发现当特异性运行标准差（run- SD）低于各自的上限时，总体假阳性率可降低至0.30%（P<0.001）。这一比率与最近3项meta分析得到的比率一致，这表明了监测和减少高运行SD的重要性。 

图2. 常见三体（上行）和未受影响（下行）妊娠的染色体z值与染色体特异性运行标准差（run- SD）的比较。

对于一些初始结果为临界真阳性或假阴性的三体妊娠，研究团队对其提供的另一样本重新进行了检测（2例假阴性和2个临界真阳性的13号三体综合征病例）（图3）。结果显示，4例病例都具有相同的初始和重复运行，且运行SD较低（从>0.80%到0.40%），其中3例的重复Z评分较高。

图3. 重复5例假阴性或临界真阳性病例结果。

综上所述，基于测序的cfDNA筛查常见常染色体三体的方法在过去十年中不断发展。目前，RCA方法正处于入门阶段，随着制造的发展、分析的细化，其可能会得到改进。该研究评估了基于RCA的cfDNA方法的筛查性能，包括在21-三体性的检出率，假阳性和测试失败率。结果显示，RCA和其他5个简化系统的早期评估结果令人鼓舞。

参考文献：

Glenn E Palomaki, Elizabeth E Eklund, Edward M Kloza, Geralyn M Lambert-Messerlian. Assessment of a Simplified Cell-Free DNA Method for Prenatal Down Syndrome Screening. Clinical Chemistry, hvac131. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvac131

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