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单细胞RNA测序平台
技术平台
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SMART-seq
2012年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为Smart-Seq（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）的技术[1]。在2013年， Nature Methods杂志上报告了新的方案，被称为Smart-Seq2[2]，随后在2014年他们有公布了详细的操作流程[3]。获取单细胞并裂解细胞后，含有oligo-dT的引物与mRNA的poly-A结合，逆转录酶MMLV进行逆转录，逆转录酶到达mRNA 5’末端时，MMLV的末端转移酶活性会在一链cDNA的3'末端增加额外的胞嘧啶，这时TSO引物3'末端的rGrG+G结合到第一链末端的胞嘧啶，然后以第一链cDNA为模版进行延伸合成互补的第二链，全长cDNA经过PCR扩增后进一步进行测序文库的构建。
固定布局
工具条上设置固定宽高
背景可以设置被包含
可以完美对齐背景图和文字
以及制作自己的模板
SMART-seq2技术原理
技术优势
起始量低
1个细胞起始，适用于难以满足10X Genomics等平台起始细胞量要求的样本。
覆盖度高
测序覆盖cDNA的全长序列，每个细胞能够获得上万个基因的表达。
信息全面
除了获得基因表达信息，数据能够用于可变剪接，cSNP等分析，以及带poly-A结构的lncRNA研究。
SMART-seq2文库示意图
建议测序深度及参数
样本要求
类型：
新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
来源：
血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
样本量：
单个细胞（或微量细胞）。
保存运输：
细胞放入SMART-seq试剂盒指定的裂解液中，-80°C保存，干冰运输。
10X Genomics
10X Genomics公司的Chromium系统利用8通道的微流体“双十字”交叉系统，将含barcode的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMs（油包水的微体系）。GEMs形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRNA逆转录产生带有10X barcode和UMI信息的cDNA，构建标准测序文库，其中10X barcode用于区分细胞，UMI用于区分mRNA分子。
固定布局
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以及制作自己的模板
10X genomics技术原理
技术优势
通量高
一张芯片具有8个独立的通道，可供8个样本同时上机，每个通道最高可捕获10000个细胞。
捕获率高
单细胞捕获效率高达65%，多细胞比例<0.9%（1,000个细胞中）。
延展性强
除了获得单细胞mRNA的信息，还提供了单细胞TCR/BCR、单细胞表面蛋白、单细胞ATAC等多种解决方案。
10X Genomics 3’ gene expression文库示意图
建议测序深度及参数
样本要求
类型：
新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
来源：
血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
样本量及其它质控要求
细胞悬液：
> 10*目标细胞个数（最少10,000个细胞）；
活率>80%；
浓度500-1,000个细胞/ul；
细胞间无粘连（成团率<5%）；
无大于40um的细胞碎片或其他颗粒物；
不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。
血液：
EDTA抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
组织：
0.3cm×0.3cm（不超过0.5×0.5cm）的新鲜组织，4~5块。
保存运输
细胞悬液：
最好现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C运输，48小时内送达伯豪生物实验室。
血液：
EDTA抗凝的全血，4°C运输，2小时内送达伯豪生物实验室；或提取PBMC后冻存，干冰运输。
组织：
建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C运输，48小时内送达伯豪生物实验室。
BD Rhapsody
BD Rhapsody技术利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记微球上实现单细胞捕获和mRNA转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于cDNA扩增和文库构建。可满足100~10000个细胞的自动分选、扩增及建库。
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BD Rhapsody术原理
此外，该技术使用带有寡核苷酸的高质量抗体（Ab-oligos），这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码，细胞在经过Ab-oligos标记后，可在单细胞水平同时获得转录组和蛋白表达。
单细胞mRNA与蛋白同时测序
BD Rhapsody基因表达文库示意图
建议测序深度及参数
技术优势
高效
每个样本可测100~10000个细胞；
2天内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库。
灵活
抗体标签技术可实现多样本混合捕获；
可选择全转录组测序或目标基因测序。
可靠
利用成像系统对单细胞捕获过程进行质控；
单细胞捕获效率高达80%，多细胞比例<1%（1,000个细胞中）。
整合
可同时检测单个细胞的mRNA水平与蛋白水平。
样本要求
类型：
新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
来源：
血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
样本量及其它质控要求
细胞悬液：
> 10*目标细胞个数（最少10,000个细胞）；
活率>80%；
浓度500-1,000个细胞/ul；
细胞间无粘连（成团率<5%）；
无大于40um的细胞碎片或其他颗粒物；
不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。
血液：
EDTA抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。
组织：
0.3cm × 0.3cm（不超过0.5 × 0.5cm）的新鲜组织，4~5块。
保存运输
细胞悬液：
最好现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C运输，48小时内送达伯豪生物实验室。
血液：
EDTA抗凝的全血，4°C运输，2小时内送达伯豪生物实验室；或提取PBMC后冻存，干冰运输。
组织：
建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C运输，48小时内送达伯豪生物实验室。
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参考文献
[1] Ramskold D, Luo S, Wang YC, et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol 2012, 30(8):777-782.
[2] Picelli S, Björklund ÅK, Faridani OR, et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods 2013, 10(11):1096-8.
[3] Picelli S, Faridani OR, Björklund AK, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc 2014, 9(1):171-81.
[4] Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods 2009, 6(5):377-382.
[5] Yan L, Yang M, Guo H, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013, 20(9):1131-1139.
[6] Cui Y, Zheng Y, Liu X, et al. Single-Cell Transcriptome Analysis Maps the Developmental Track of the Human Heart. Cell Rep 2019, 26(7):1934-1950.e5.
[7] Zhou F, Li X, Wang W, et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution. Nature 2016, 533(7604):487-92.
[8] Zhou J, Xu J, Zhang L, et al. Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals that H19 Is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development. Cell Stem Cell 2019, 24(2):285-298.e5.
[9] Li CL, Li KC, Wu D, et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Res 2015, 26(1):83-102.
[10] Zheng C, Zheng L, Yoo JK, et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 2017, 169(7):1342-1356.
[11] Kim D, Kobayashi T, Voisin B, Jet al. Targeted therapy guided by single-cell transcriptomic analysis in drug-induced hypersensitivity syndrome: a case report. Nat Med 2020,26(2):236-243.
[12] Yu Zhao, Zixian Zhao, Yujia Wang, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCov. bioRxiv 2020.
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