Visium空间转录组哪些常见问题？这里有你想要的答案！
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什么是Visium空间转录组？
Visium空间转录组是在组织原位检测全转录组基因表达的一种技术，使得我们在检测基因表达水平的同时，获得基因在组织内部空间表达的位置信息。与空间转录组相比，传统的全基因转录组或单细胞转录组测序，丢掉了基因或细胞在组织内的空间分布信息，而广泛应用的RNA探针杂交，这只能同时检测有限的几个基因在组织内的空间表达分布。而空间转录组可以将基因表达与H&E染色的结果叠加在一起，不需要对组织进行消化，从而保留了组织内部的空间结构，这样使得我们可以研究组织内部不同区域的细胞异质性。
Visium空间转录组的工作原理？
Visium基因表达玻片上有4个捕获区域，也就是图片上展示的4个小方框，每个捕获区域的大小是6.5mm乘6.5mm，每个捕获区域大约有5000个spot，也就是图上所示的小圆点，每个spot的直径是55µm，两个spot的中心点的距离是100µm，每个spot上面有数百万条oligo。每个spot上所有oligo的Spatial Barcode的序列都是相同的，而不同的spot之间Spatial Barcode是不同的，这样通过Spatial Barcode，就能够知道每条mRNA到底位于哪个spot，也就获得了mRNA的空间位置信息。UMI用于基因表达定量，可以知道每个spot上有哪些基因表达以及他们的表达量。poly-A用于捕获mRNA。4个捕获区域内的Spatial Barcode是相同的，但每个捕获区域内不同的spot之间Spatial Barcode是不同的。
公司内部空间转录组实验流程？
总实验流程分为三个部分：
一是样本制备及预实验，二是组织优化，三是基因表达。
样本制备及预实验实验流程：
首先获取组织样本，进行冷冻，OCT包埋，将包埋好的组织进行冰冻切片，将切好的组织放置于常规玻片上。接下来对组织切片进行固定，H&E染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片进行明场拍照。同时切10片厚度为10 µm的冰冻切片，提取RNA，通过计算RIN值来评估其质量。为了获得最好的实验结果，建议用RIN值大于7的组织块做Visium的实验。
组织优化的实验流程：
首先对OCT包埋的组织进行冰冻切片，将切好的组织放置于组织优化玻片上的捕获区域。接下来对组织切片进行固定，H&E染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片拍照，拍照完成后会继续对组织切片进行通透处理，使细胞内的mRNA释放出来，被玻片上的oligo所捕获，在合成一链cDNA的时候，掺入带有荧光基团的碱基，这样合成好的cDNA就带有荧光，接下来会通过酶消化去除玻片上残留的组织，暴露带有荧光的cDNA，用Cy3通道的荧光显微镜，扫描整张片子，获得荧光染色的图片，组织优化的所有实验都在玻片上完成。
基因表达实验流程：
先对OCT包埋的组织进行冷冻切片，将切好的组织切片放置于基因表达玻片上的捕获区域。接下来对组织切片进行固定，H&E染色，用带扫描功能的显微镜对组织切片进行拍照，获得组织形态信息。拍照完成后会继续对组织切片进行通透处理，使细胞内的mRNA释放出来，被玻片上的oligo所捕获，在玻片上进行一链和二链cDNA的合成，合成二链cDNA后会做变性处理，将合成好的二链cDNA回收到ep管中，后面的所有实验都在ep管中完成，包括cDNA的扩增和文库的构建。空间基因表达实验可以分为两个部分，第一部分从组织固定到二链cDNA的合成，都是在基因表达玻片上完成。第2部分从cDNA的扩增到文库的构建，都是在ep管中完成。
为什么要用异戊烷冷冻，而不是液氮直接冷冻？
之所以用异戊烷冻存组织，而不是将组织直接放置于液氮中，是因为液氮的沸点比较低，如果将组织直接放到液氮里，液氮会沸腾，在组织周围形成气穴，导致组织不同区域的降温速度不同，容易在速冻过程中改变组织内部的形态，甚至使组织发生碎裂。而异戊烷的沸点比较高，将组织放置于异戊烷中，异戊烷不会沸腾，这样组织不同区域降温速度相同，就避免了在速冻过程中发生变形或者是碎裂。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是否与Visium兼容？
目前只有包埋在OCT中的新鲜冷冻组织经过了Visium空间基因表达解决方案的验证。10X Genomics的研发团队成员正在积极研究FFPE组织相关的应用，并且已经获得一些初步结果，预计在2021年会推出适用于FFPE组织的实验方案。
组织是否可经过IHC染色？
目前，Visium空间基因表达流程是针对H&E染色而优化的。将IHC染色整合到此流程中是10X Genomics研发团队积极研究的另一个领域，预计在2020年上半年推出。
H&E染色是否会对样本RNA质量产生影响？
不会，10X Genomics官方实验结果表明，H&E染色不仅不会对样本RNA质量产生影响，染色后还会提高基因检测数。
组织或切片样本的转运？
运输组织样本：先用异戊烷冻存，将冻存好的组织放在密封的容器中，再将装有冷冻组织的容器用密封袋封好，放置于干冰中运输，样本到达目的地后迅速转移到-80℃冰箱保存。
运输已经贴了组织切片的玻片：可以将玻片放置于密封的容器中，并将玻片固定好，再将装有玻片的容器用密封的袋子封好，放置于干冰中运输。同样样本到达目的地后，迅速转移到-80℃冰箱进行保存。这里还要注意，一旦玻片上贴好了组织切片，只能保存7天。
Visium空间转录组目前不能够做什么组织样本？
在10X测试过的组织类型中，有三种组织还需要进一步的优化，包括样本制备的优化和组织通透性的优化，分别是皮肤，胰腺和骨组织。
Visium空间转录组能够做何种组织类型以及推荐切片厚度是什么？
10X Genomics测试过很多组织类型，绝大多数都可以用于空间转录组的分析。下图是他们官网上测试过的组织类型的列表，测试过的组织都可以运用在空间转录组的分析上面。但建议用户用基因表达玻片做正式实验前，务必用组织优化的玻片测试一下，看组织能否用于空间转录组的实验，同时也找到最佳的组织通透时间。
切片厚度基本上以10µm为主，但也有少量组织例外。
一张Visium空间基因表达玻片上可以运行不同类型的组织吗？
可以，Visium空间基因表达玻片上可以检测不同类型的组织。每张玻片包含4个捕获区域，因此一张玻片上最多可检测四种不同类型组织的切片。每种组织的最佳透化时间需要通过组织优化（TO）实验来预先确定，每种类型的组织使用一张TO玻片。
一个捕获点可以捕获不止一种类型的细胞吗？
是的，根据组织中待研究的具体区域，带条形码的捕获点可能覆盖不止一种类型的细胞。具体取决于组织类型、组织内的细胞大小以及这些细胞的密度。研究人员可看到每个点大约捕获1到10个细胞。您可以将每个捕获点想象为一种“微型批量”的实验，在这个实验中，研究人员收集一小批细胞的平均基因表达数据。这是10x Genomics的研究团队正在积极研究的另一领域，目的是尽量让捕获点变得更小。
如果有些捕获区域未使用，那么Visium空间组织优化或基因表达玻片是否可以重复使用？
无论您在处理过程中是否使用了所有捕获区域，玻片仅供一次性使用。这是因为流程中包含了多个步骤，包括对玻片进行染色、冲洗和重新干燥，这些步骤会破坏未使用的捕获区域上的寡核苷酸条形码，并降低其整体的灵敏度。
成像测试玻片的作用？
Visium配件试剂盒中的成像测试玻片有两个用途。一，确定客户的成像系统是否与Visium兼容。二，用于成像程序的设置，以便在Visium组织优化和基因表达流程中获取图像。
如何确定组织切片的空间位置信息？
在捕获区域四周有一圈由灰色小点组成的基准边界，提供组织切片的空间定位信息。
Visium空间转录组对测序读长的要求？
Visium空间转录组的文库，可以在Illumina所有测序仪上测序，文库的结构如下图所示，需要双端index测序。
建议的测序方式是为Read 1：28个bp，i7 index：10个bp，i5 index：10个bp，Read 2：120bp。Read 1 用于测试Spatial Barcode和UMI，Read 2用于测试插入片段。不建议将visium的文库与其他单index的10x文库混合测序。
Visium空间转录组对测序深度的要求？
与单细胞实验不同，我们无法根据细胞数计算空间转录组文库的测序量，因为我们不知道组织切片当中有多少细胞，我们根据组织切片占捕获区域的比例计算测序量，计算测序量的时候，只考虑被组织切片覆盖的spot，每个spot的推荐最低起始测序量是5万个read pairs，根据H&E染色的结果可以估算捕获区域到底有多少百分比的spot被组织覆盖。
计算测序量很简单，比如我们假设一个组织覆盖了捕获区50%的面积，我们就用0.5×5000×5万个read pairs per spot，得出测序量是125个million read pairs。这里面0.5就代表着覆盖了捕获区域50%的面积，5000就代表着每一个捕获区域总共有5000个spot，再乘以5万，5万就是每个spot我们推荐的最低测序的量，就是5万个read pairs per spot。测序量与组织大小、组织类型和基因表达水平相关。
在分析数据时是否需要编程或生物信息学的经验？
通常，研究人员需要具备一点点生物信息学经验来使用Space Range。Space Range流程在Linux服务器上运行；这就需要研究人员了解基本的命令行操作，以及如何登录和退出Linux服务器。不过，在大多数情况下，Space Range是高度自动化的。让软件正常运作的文件和算法都已经包含在内。因此，研究人员只需在测序后将两个输入文件提供给Space Range，让软件生成空间基因表达数据。
Loupe Browser有着完全图形化的界面，并且根本不需要编程。不过，您在研究过程中可能会碰到某个时刻，比如想了解空间基因表达数据的一个具体问题，或者创建一个自定义图形。那么，这就需要您学习R语言或其他脚本编程语言。
我已经对旧版本的空间转录组学（Spatial Transcriptomics）数据进行了测序，可以用Space Range和Loupe Browser来分析这些数据吗？
抱歉，不可以。因为数据类型不同，它们无法兼容。如果您有这种类型的数据，仍然建议您使用现有的处理空间转录组学数据的分析流程。
是否有类似于Seurat的第三方R语言工具来分析空间基因表达数据？
没错！事实上，分析空间基因表达数据的第三方工具的数量正在迅速增长。目前的一些选择包括Spaniel和Giotto。Seurat也是一种选择。Space Range流程的输出矩阵与Cell Ranger的Feature Barcode输出矩阵的格式相同。研究人员可将此输出文件直接输入Seurat中进行进一步的分析。您可以通过https://satijalab.org/seurat/v3.1/spatial_vignette.html了解Seurat流程处理空间基因表达数据的更多信息。
此外，10x Genomics的计算生物学家还创建了R资源，可以帮助客户对其样本开展深度分析。这些R资源让研究人员能够一次观察多个基因、样本或特征，如基因、UMI和聚类。如果研究人员想分析不同特征的样本，或不同实验条件下的样本（如野生型、患病和治疗中的样本），这可能特别有用。您可以在我支持网站上访问这些R资源(https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/software/pipelines/latest/rkit)。
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